一株缩合单宁降解菌的筛选、鉴定及降解效果分析

陈度宇, 王 森, 张 宇, 许 雷

中国农业科学院研究生院, 北京 100081

植物单宁，又称植物鞣质(vegetable tannin)，是植物体内产生的，能使生皮成革的复杂多酚。它是植物的次生代谢产物，属于天然有机化合物。Freudenberg根据其化学结构特征首次将其分为水解单宁(hydrolysable tannin)及缩合单宁[1]。缩合单宁也称原花青素，是以无分支黄酮类化合物为主的聚合物，其母核结构为黄烷醇，分子中的芳香环以C-C键连接，其分子骨架为C6-C3-C6，在水溶液中不容易发生分解，而大部分缩合单宁在热强酸的作用下能产生花色素，故而这类化合物又被称为原花色素[2]。植物单宁分布广泛但利用率很低，而缩合单宁作为其中一种重要的天然可再生资源，如何提升其利用率一直是研究的目的所在。缩合单宁的分子量和聚合度大小对其化学特性和生物活性具有显著的影响。含缩合单宁的植物饲料如高粱等具有抗营养作用，即一种被认为是由多种因素综合影响动物对植物的消化与吸收的作用。

落叶松树皮、葡萄皮及成熟的深色高粱籽皮富含原花青素类缩合单宁，且结构单元为儿茶素。儿茶素是最重要的一类黄烷-3-醇化合物，化学结构为5,7,3′,4′-四羟基黄烷-3-醇，除研究较多的(+)-儿茶素外还有3种立体异构体[(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素]。儿茶素的生物活性和应用价值都比缩合单宁更佳，更容易被动物体吸收利用，一些研究认为儿茶素具有的强抗氧化活性可以清除人体自由基，延缓衰老；作为黄酮类物质，它还具有一定的预防心血管疾病和癌症的作用；并且在降低血压、血糖、血脂方面有一定的作用，对控制中心性肥胖也有一定效果。研究者们根据植物体中原花青素由黄烷醇单体缩合而成的合成途径逆向推断出缩合单宁的优势降解产物为儿茶素[3]，因此有效降解缩合单宁对提升其应用价值很有意义，而且可以为进一步研究如何提高含单宁植物饲料的营养价值和探索单宁在医药、食品、化妆品等精细化学品领域应用提供研究基础。

单宁的降解主要有两种方法：化学降解和生物降解，目前缩合单宁的解聚主要依靠化学手段，但显然不如生物降解环保、安全、成本低、易操控。所以分离出能有效降解缩合单宁为儿茶素的微生物菌株十分有意义。早在1867年，Vantieghem就发现了1株青霉(Penicilliumglaucum)能够将五倍子中的单宁降解为没食子酸[4]。Bhat等综述了目前常见的单宁降解菌发现,具有单宁降解能力的微生物大多是霉菌,其中又以青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)种类居多[5]。1999年，McSweeney等首次报道了以缩合单宁为单一碳源的瘤胃细菌[6～8]。罗欣[9]利用黑曲霉将茶多酚多聚体降解为儿茶素单体进行了研究，并对降解条件进行了优化，实验中发现黑曲霉对茶多酚多聚体具有良好的降解效果；刘继伟[10]进行了青霉菌降解沙棘籽原花青素的研究，优化了降解条件并对降解机理做了较深入的探讨；兰平等[11]选取青霉和米曲霉进行了葡萄皮单宁的降解研究，研究了不同的降解工艺参数对降解效果的影响。缩合单宁降解菌株的筛选鉴定研究可以为证明缩合单宁生物降解可行性提供可靠依据，同时为进一步研究缩合单宁降解酶打下基础，有助于最终实现工业化降解缩合单宁生产儿茶素，提高缩合单宁利用率，十分符合资源节约环境友好型社会的发展要求。

1 材料与方法

1.1 材料来源

缩合单宁材料选用落叶松单宁(聚原花青素>95%)购自北京百奥科利有限公司，经正丁醇盐酸显色法检测所购落叶松单宁溶液颜色变红，证明所购材料为缩合单宁，通过香草醛法绘制的质量浓度和物质的量浓度标准曲线，再根据公式计算得到样品缩合单宁的聚合度是3，即说明购买的落叶松单宁主要成分为三聚体缩合单宁。

标准品儿茶素[(+)-catechin，色谱纯，Sigma公司]，原花青素标准品(proanthocyanidins B1色谱纯，Sigma公司)。

菌源为中国农业科学院饲料所南口养殖基地牛羊圈新鲜粪土。

1.2 培养基配制

驯化培养基：NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，121℃高压灭菌20 min，加入制霉菌素5 mg/100 mL，放线菌酮2 mg/100 mL，加入落叶松单宁(滤灭溶液)浓度从0.1 g/L一直提高到2 g/L。

筛选培养基：NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，琼脂1.8 g/L， 121℃高压灭菌20 min，加入适量落叶松单宁滤灭液。

LB平板(LB固体培养基)：蛋白胨1 g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 1 g/L。

1.3 实验方法

1.3.1样品缩合单宁的检测及其聚合度的鉴定 用正丁醇-盐酸显色法[12]：在0.5 mL所购落叶松单宁配置的一定浓度的水溶液中加入5 mL正丁醇(含5%HCl)95℃水浴2 h后观察颜色变化,用紫外分光光度计(Thermo公司，美国)测定550 nm处吸光度建立标准曲线用于计算缩合单宁浓度。

香草醛法[13]：用甲醇和乙酸分别配制系列浓度(25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、300 mg/L)的儿茶素标准品和浓度为100 mg/L的落叶松单宁样品，用香草醛-甲醇法(2 mL样品+5 mL 1%香草醛-甲醇溶液+5 mL 20%硫酸甲醇，室温避光反应15 min，紫外分光光度计500 nm处检测吸光度)分别测甲醇配制的标准品和样品，根据标准品的结果绘制质量浓度标准曲线计算样品的质量浓度m(g/L)，而香草醛-乙酸法(2 mL乙酸配制的样品+5 mL 0.5%香草醛-甲醇溶液+5 mL 10%硫酸甲醇，室温避光反应5 min，紫外分光光度计500 nm处检测吸光度)则用于测定绘制物质的量浓度标准曲线以计算样品的物质的量浓度n(mol/L)，最后根据公式DP=m/(n×M)计算出平均聚合度，其中M为儿茶素分子质量290.27。

1.3.2驯化培养与分离筛选 取适量粪土样品于250 mL锥形瓶中加入无菌生理盐水100 mL，30℃震荡培养7 d，然后静置，取部分上清液加入驯化培养基中，30℃震荡培养7 d，然后静置，取上清加入单宁浓度稍大的培养基中，按此步骤重复操作逐步提高培养基中单宁浓度至5 g/L。

将富集驯化的培养液梯度稀释后涂布于筛选培养基平板，30℃培养，观察长菌情况，挑出有降解圈的单菌落，在LB平板上重复划线分离纯化后4℃密封保存。利用Biolog对菌株进行生理生化测试初步鉴定菌种。

1.3.3菌种鉴定 利用16S rRNA基因测序比对对菌株进行菌属鉴定：将筛选出的菌株用LB液体培养基30℃振荡培养过夜，用于基因组提取。用TaKaRa基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因的通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)PCR扩增菌株的16S rRNA基因片段。PCR程序为：95℃预变性5 min; 95℃ 变性35 s，50℃ 退火30 s，72℃ 延伸90 s ，35个循环; 72℃延伸5 min。引物的合成和PCR产物的测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。将得到的测序结果在NCBI网站进行Blast，分析比对结果，构建系统发育树确定菌属。

1.3.4菌B1生长曲线的测定 分离出单菌落分别接种于加入和未加入缩合单宁的LB培养基中，30℃ 160 r/min震荡培养，收集36 h内不同时间点菌液用紫外可见分光光度计测OD值(OD600)，绘制生长曲线。

1.3.5液相色谱法测定菌液中成分的变化 液相色谱法：样品经0.22 μm的孔径无菌滤膜过滤后，使用Agilent 1200 高效液相色谱仪(Agilent公司，美国)，方法为：色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)，流动相:乙腈:0.5%磷酸水(V/V)=85∶15，上样量2 μL，流速0.8 mL/min，柱温30℃，利用二极管阵列复合波长检测器进行检测，检测波长为280 nm。利用液相色谱法建立原花青素和儿茶素的标准曲线，每隔12 h收集一次培养液过滤后检测计算其中成分的变化情况。

1.3.6不同碳源和氮源对菌株生长的比较试验 以筛选培养基为基础，2种外加碳源培养基分别添加0.2 g/L的葡萄糖和蔗糖，两种外加氮源培养基则在以不添加NaNO3的筛选培养基为基础，分别添加牛肉膏和蛋白胨，4种培养基各接入1%菌液，30℃ 160 r/min摇床培养，每隔12 h取1瓶菌液样品经0.22 nm无菌滤膜过滤后液相色谱法(同1.2.6)测定计算菌液中缩合单宁的降解率，分析不同碳源和氮源对缩合单宁降解情况的影响。

降解率=(对照样品中浓度-处理样品中残留浓度)/对照样品中浓度×100%

1.4 数据结果分析

使用Origin 8和Microsoft Excel 2010分析处理数据，绘制图表。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1菌株的驯化筛选和Biolog测定 因为缩合单宁有一定的抑菌性，粪土样品中的多数菌并不能生长，所以含较高浓度缩合单宁的筛菌培养基平板上很难长出菌，菌B1由于能利用缩合单宁，故能在平板上长出并有降解圈现象，肉眼观察其菌落为白色规则平滑圆点，显微镜下观察到是一种运动活跃的短杆细菌，通过Biolog试验对菌B1进行生理生化鉴定，一些基本特性结果如表1所示，鉴定结果显示菌B1可能为肠杆菌属(Enterbacter)。

表1 菌株B1 生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain B1．

2.1.2菌株16S rRNA 基因序列鉴定 菌株B1的16S rRNA基因序列在NCBI上比对分析的结果表明，菌株B1的16S rRNA 基因序列与多株Enterobactersp.的序列相似度为99%，采用邻接法构建系统发育树( 图2所示) ，菌株B1 (图2)与Enterobacterxiangfangensis10-17T聚为一支，故断定菌株B1 为肠杆菌(Enterobactersp．)。经Biolog试验分析和16S rRNA基因测序比对均证实菌B1为肠杆菌(Enterobactersp．)。

2.2 菌B1生长曲线

如图3所示，菌株B1在LB 液体培养基中生长较快，约3 h可进入对数生长期直至24 h 后进入平台生长期，最大OD600值2.5左右。在加入缩合单宁的培养基中，菌B1生长则受到明显抑制，生长达到平台期所花时间明显延长，9 h才进入生长期，且最大OD600值小于2.5,略低于未加入缩合单宁的培养基中的值(图3)。但是总体生长趋势上菌B1受到的影响并不大，由此看出菌B1对缩合单宁表现出较好的抵抗能力，这也是菌B1能降解缩合单宁的重要前提。

图2 基于16S rRNA基因序列同源性的B1系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of B1 and related stains.注:节点值是1 000次重复抽样分析的支持百分率。

图3 菌株B1生长曲线Fig.3 The growth curve of strain B1.

2.3 菌B1对缩合单宁的降解情况

缩合单宁在降解过程中，先由聚合体解聚为单体，单体可以被微生物利用，所以在检测缩合单宁降解情况过程中通常以原花青素和儿茶素的变化作指示。结合图4和图5，可以推断菌株B1对缩合单宁具有降解作用。

图4是紫外分光光度法测定发酵液中缩合单宁变化从而绘制得到的菌B1缩合单宁降解率曲线，从图中可以看到，降解率在72 h达到93.46%，在84 h之后由于正丁醇盐酸反应不变红且吸光值很小故推测已经不含缩合单宁，即降解率为100%。

图5是液相色谱法测定菌B1发酵液中原花青素和儿茶素随时间的变化量。从图中可以看到菌液中原花青素含量随时间降低明显，空白对照(未接菌的培养基)中原花青素降低不明显，从0 h开始原花青素含量急剧减少，36 h后减势趋于平缓，72 h时空白对照组与实验组中原花青素含量差别最大，推测此时缩合单宁降解达到最大值， 72 h后原花青素浓度小于5 mg/L；相比之下儿茶素从12 h后开始生成，浓度不断升高，48 h后上升趋势逐渐减慢趋于平缓，生成的儿茶素最大浓度约20 mg/L，而在空白样中检测到的儿茶素浓度几乎可以忽略不计。

2.4 外加碳源和氮源对缩合单宁降解的影响

从图6可以看到菌B1在4种外加碳/氮源培养基培养过程中对缩合单宁的降解情况，加葡萄糖的培养基中缩合单宁的降解率在20%上下波动，这说明在能够以葡萄糖为碳源时明显看出菌B1对缩合单宁降解率低且无明显规律，在加蔗糖的培养基中，36 h前缩合单宁的含量不降反增，说明添加蔗糖的培养基不能加速促进菌B1对缩合单宁的降解，36 h后降解率才逐步上升，此时表明菌B1开始降解缩合单宁；而加入蛋白胨和牛肉膏的培养基中缩合单宁降解率都呈上升趋势，尤其是加入牛肉膏的培养基中，36 h后都基本检测不到缩合单宁，故认为此时降解率为100%。对比无外加碳氮源随时间逐渐增大，36 h后变化缓慢，60 h和72 h时都为88%，可以看出外加牛肉膏氮源更利于菌B1对缩合单宁的降解。

图4 菌B1发酵过程中缩合单宁降解率Fig.4 Degradation ratio of condensed tannins in fermentation by strain B1.

图5 菌B1发酵过程中原花青素和儿茶素浓度Fig.5 Concentration of procyanidins B1 and (+)-catechin in fermentation process by strain B1.

图6 缩合单宁降解率变化情况Fig.6 Changes of condensed tannins degradation rate.

总而言之，外加碳源使菌B1不需要降解缩合单宁来维持生长，故缩合单宁降解延后或无明显规律；而氮源的不同则使菌B1降解能力出现差异，牛肉膏明显更有助于菌B1对缩合单宁的降解。

3 讨论

国内外关于单宁降解的研究不少，但多集中于对水解单宁的降解研究，缩合单宁降解菌的研究很少且多为霉菌。本实验驯化筛选到了一株能以缩合单宁为单一碳源生长的细菌B1，经鉴定为一株肠杆菌(Enterobactersp.)，经比对和系统发育树构建发现其与香坊肠杆菌聚为一支，相似度最高。菌B1对缩合单宁的抑菌性有抵抗力，在含缩合单宁的培养基中细胞生长趋势受影响小，菌株表现出较好的缩合单宁降解能力，无论是正丁醇盐酸法还是HPLC，检测结果都表明菌B1对缩合单宁的降解率高达90%以上。来自肠道菌群的菌B1驯化后所表现出的强缩合单宁降解能力对消除饲料的抗营养作用、增强动物对含单宁饲料的吸收都有应用意义。而且，菌B1能将缩合单宁解聚为儿茶素从而有效利用缩合单宁生长，利用液相色谱检测到菌B1在3 d内便通过降解缩合单宁生成约20 mg/L的儿茶素。这是研究缩合单宁为生物降解中首次获得的能有效将缩合单宁降解为儿茶素的细菌，这也为黄酮类物质的获得开辟了新路径，且细菌从细胞结构上比霉菌更便于研究，可以方便进一步挖掘微生物降解缩合单宁的关键基因与作用酶，可以以此进一步验证单宁降解菌的降解机制和降解途径，从而大大加快缩合单宁降解为儿茶素的工业化应用的实现，提高缩合单宁的降解率，为下一步研究缩合单宁降解酶和相关基因作准备，也可以为进一步探索细菌对缩合单宁的降解过程提供实验基础。研究后续将构建菌B1的基因组文库，筛选验证降解的关键基因，进一步探究缩合单宁降解的机理。