等温核酸扩增技术在病原体检测中的应用

彭 志, 陈刚毅, 刘雪飞, 黄新河*

1.西南交通大学生命科学与工程学院, 成都 611756;2.中国科学院成都生物研究所, 成都 611041

由病原体引起的感染性疾病一直严重威胁着人体健康，其可分为传染性和非传染性。而抗生素是用于预防和治疗细菌性传染病的重要药物，但抗生素的滥用导致具有多重耐药性的菌株不断产生，极大地增加了临床治疗的难度，也导致了严重的公共卫生污染问题。与此同时，各种流感病毒的变异速度也不断加快，使病毒性疾病的防控和治疗面临着严峻的挑战。病原体检测是传染病防控的重要环节，然而，传统的病原体检测方法存在耗时长、对培养环境要求高、检测的样品量少、检测价格高等弊端，难以满足临床需求。随着分子生物学研究的发展和深入，快速、准确、低成本、高通量、适用范围广的核酸检测技术被广泛应用于病原体检测中。

脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)对于所有形式的生命都是至关重要的，同时核酸也是生物学研究和医学诊断中的重要生物标志物[1]。随着核酸研究工作的不断开展，核酸扩增成为基础研究、传染病防控、临床诊断等领域非常重要的工具。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是目前使用最为广泛的核酸扩增技术[2]，但PCR有其固有的局限性，如扩增过程需要升降温度，对PCR仪的依赖性较强，同时对操作人员的专业技术要求较高等，从而使其耗时长、成本高，难以实现现场快速检测。

自20世纪90年代以来，产生了多种等温核酸扩增技术，其共同特点是可在固定的温度条件下实现核酸的快速扩增或检测。由于反应不依赖热循环，检测成本大幅降低，且可实现对食品、农作物和病原体等现场快速检测，极大地提高了检测效率。在现有的等温核酸扩增技术中，关于环介导等温扩增技术的研究开展最多，其应用也最为广泛。其他较为常见的等温扩增方法有依赖核酸序列扩增、依赖解旋酶扩增、重组酶聚合酶扩增。本文综述了上述等温扩增技术的核酸扩增原理、重要特性及其在病原体检测中的应用进展，以期为此类技术的推广和应用提供参考。

1 等温核酸扩增技术

得益于分子生物学和体外模拟核酸扩增技术的快速发展，自20世纪90年代初以来，已开发了数十种采用各种放大机制的等温核酸扩增技术。其中，大多数技术对于核酸的检测具有相当高的灵敏度，且部分技术已经取得了商业上的成功[3,4]。因而，在此综述几种研究较多、应用较广的等温扩增技术的原理、特性等，如依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依赖解旋酶扩增(helicase-dependent amplification，HDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)。

1.1 依赖核酸序列扩增技术

依赖核酸序列扩增技术是1991年由Compton[5]提出的用于扩增单链RNA序列的技术。其过程依赖于3种酶：禽成髓细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)反转录酶、核糖核酸酶H(RNase H)和T7 RNA聚合酶，以及2种特异性引物：引物1的3′端与目标序列的3′端互补，5′端带有可被T7 RNA聚合酶识别的启动子，而引物2来源于目标序列的5′端。

其扩增单链RNA中特定序列的过程可分为非循环阶段和循环阶段。在非循环阶段，引物1与模板RNA中的目标序列结合，在AMV反转录酶的作用下，从引物1的3′端开始延伸，合成模板RNA的1个cDNA拷贝，从而形成RNA:DNA杂合体，再由RNase H消化RNA，余下的单链DNA与引物2结合，与启动子区域互补，形成双链DNA。T7 RNA聚合酶通过识别启动子，将其转录为与初始RNA互补的目标序列RNA(-)，每个初始RNA可产生100个拷贝，而新合成的RNA(-)又可作为循环阶段的模板。在循环阶段，引物2先与模板结合，并在反转录酶的作用下延伸，从而形成RNA:DNA杂合体，再由RNase H消化RNA。而引物1与余下的单链DNA结合，反转录合成带有启动子的双链DNA，然后在T7 RNA聚合酶的作用下，又转录为RNA(-)。

上述步骤不断循环最终获得大量的与初始RNA互补的目标序列RNA(-)。在41℃条件下，NASBA技术在1.5～2 h内可实现109倍的扩增，扩增效率与逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR，RT-PCR)相当。由于单链RNA易产生二级结构，因此，扩增复杂的RNA需要先于65℃孵育消除二级结构，从而更利于扩增反应的进行。此外，由于RNA易降解，所以整个扩增和检测反应都需要严格控制反应条件以防止RNA降解。NASBA也可用于DNA的扩增，最常用的方式是在扩增前将DNA加热变性，再依照同样的原理和步骤进行反应，扩增产物仍是RNA[6]。

1.2 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术于2000年首次被Notomi等[7]提出，受到了世界卫生组织、各国学者和相关政府部门的高度关注。之后，关于LAMP技术的研究陆续开展。该方法利用4条引物[外引物F3和B3、正向内引物(forward inner primer，FIP)和反向内引物(backward inner primer，BIP)]来识别待扩增的DNA序列两端的6个特异性结合位点(引物与模板链之间的序列关系如图1A,彩图见图版二)，以实现等温扩增反应。LAMP反应依赖于具有链置换活性的DNA聚合酶来进行延伸，包括2个阶段：起始结构产生阶段(第一阶段)和循环扩增阶段(第二阶段)。

在第一阶段(如图1B)中，FIP与模板结合延伸产生的单链DNA被通过外引物F3延伸产生的单链DNA置换出来，随后，此单链DNA充当2个引物(BIP和B3)的模板，配对延伸形成哑铃状的DNA结构。第二阶段(如图1C)中，内引物识别结合哑铃状DNA的loop区域，循环扩增过程由2对内引物交替启动，使得靶序列以指数倍增长，可在1 h内积累109个拷贝。

2002年，Nagamine等[9]提出通过加入loop引物的方法来加速整个扩增过程，使扩增时间缩短了一半。2003年，Mori等[10]发现LAMP扩增反应中产生的焦磷酸与溶液中的镁离子结合产生的沉淀可使整个体系变得浑浊，从而提出了通过检测浊度变化对反应进行实时监测。但通过浊度监测扩增过程并不具有特异性，即如果扩增的是非目标序列也能产生沉淀。2011年，Kubota等[11]设计了一种包含荧光标记(fluorescence label)和淬灭基团(quencher)的同化吸收探针(assimilating probe)来实时监测扩增过程。因探针只能和目标序列特异结合，从而解决了检测信号的特异性问题。最近，Qin等[12]将免疫磁珠分离技术与LAMP相结合，从而快速、特异地检测出碎牛肉中的大肠杆菌。由于LAMP具有在扩增核酸灵敏度上的优越性能，使其能够捕获和检测到肉样品中浓度低至3×101CFU/mL的细菌。因而，适合作为基础实验室和实地检测中的筛选实验。然而，由于LAMP技术中所使用的4种引物要与6个目标区域覆盖，使得LAMP的引物设计非常复杂，这也是该扩增方法在实际应用中的难点。此外，哑铃状的DNA结构一旦产生，其后的循环扩增反应便不需要外引物也能非常灵敏、高效的进行，但若在同一个环境对同一段目标序列进行重复实验，则极易造成阴性对照组的污染[13]。故市面上利用LAMP技术的商业病原体检测试剂盒多为一次性使用产品。

1.3 依赖解旋酶扩增技术

依赖解旋酶扩增是一种通过模拟体内DNA复制来进行扩增的方法[14]。与聚合酶链式反应(PCR)不同的是，该方法能等温扩增更长的DNA序列，而这正是目前医学临床诊断和生物学基础研究所迫切需要的。在HDA中，DNA解旋酶(helicase)被用来解开初始目标序列，随后，引物再与产生的DNA单链结合，在DNA聚合酶(polymerase)的作用下形成新的目标DNA序列。与PCR类似，HDA反应也分为3步：模板分离、引物结合与引物延伸，只是双链DNA是通过解旋酶打开的，而不是PCR中利用温度升高而实现的DNA变性解旋。最初的HDA反应中，由于大肠杆菌UvrD解旋酶的热稳定性很弱，反应温度固定为37℃[15]。后来，Motré等[16]发现一种热稳定蛋白质酶，该酶实质上是Tte-UvrD和Bst DNA聚合酶通过卷曲螺旋域连接在一起的复合体，使得该反应能在较高的温度(60～65℃)下高效率地进行，提高了对病原体和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点检测的特异性和灵敏度。PCR的添加剂(如二甲基亚砜、甜菜碱、山梨糖醇等)可减少DNA二级结构的产生，并有利于引物退火，同样也可在HDA扩增中有效地提高目标序列的产量和特异性[17]。但是，这些添加剂也会极大地降低聚合酶的活性。因此，测试不同浓度以找出每个扩增系统的最佳条件非常重要。HDA还可与纳米技术结合，2017年，Sedighi等[18]开发了一种纳米颗粒辅助的新型HDA,称为nanoHDA。该方法利用对单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)具有优先亲和力的金纳米颗粒(Au nanoparticles，AuNPs)来提高解旋酶的变性效率。同时，纳米颗粒的相同亲和性还可以抑制引物二聚体的形成，从而提高特异性。目前，Sedighi等[18]已经实现用nanoHDA对来自结直肠癌患者的基因组DNA样品中的KRAS基因进行基因分型。

1.4 重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增是利用重组酶解开双链模板的一种等温扩增方法，其无需预处理DNA样品即可实现核酸的指数扩增。Piepenburg等[19]证明了该技术能检测少于10个拷贝的基因组DNA，反应敏感、特异且快速。在重组酶聚合酶扩增中，通过重组酶-引物复合体识别双链模板同源区域来启动整个过程。一旦复合物找到特定的结合位点，重组酶即可解开双链，允许引物和靶序列的杂交。这个过程由单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein，SSB)辅助，将其结合到被打开的DNA单链上，从而使整个过程得以延续。然后引物延伸合成新的DNA单链，取代旧链。新合成的双链又可作为下一个周期的模板，从而实现指数放大。RPA可在低温(37～42℃)条件下于40 min内积累数百万的目标DNA拷贝[19]。近几年，研究人员发现在RPA中加入反转录重组聚合酶(reverse-transcription recombinase polymerase)，能实现RNA的扩增，进而为RNA病原体的检测开辟新的道路[20]。最近，Garrido-Maestu等[21]对RPA进行了开发及广泛的评估。在纯细菌DNA的评估中，RPA比qPCR的灵敏度高10～100倍，并且针对真实食物样品测试时，显示了高度的一致性。此外，该方法的检测限极低(低于10 CFU/25 g)。因此，证明了RPA的优秀性能及其在食品工业中实施的充分性。

图1 环介导等温扩增方法的原理[8]Fig.1 Principle of loop-mediated isothermal amplification method[8].注：A：LAMP反应的引物设计。为了便于解释，在目标DNA上标出了6个不同的区域，从5′端标记为F3、F2、F1、B1c、B2c和B3。由于c代表互补序列，F1c序列与F1序列互补。在LAMP方法中使用2个内部引物(FIP和BIP)和外部引物(F3和B3)。FIP(BIP)是由F1c(B1c)序列和F2(B2)序列组成的杂交引物；B：起始结构产生阶段。从FIP开始的DNA合成如下：F2区与目标DNA上的F2c区结合并启动延伸，以类似的方式用BIP进行DNA扩增。F3引物与目标DNA上的F3c区域结合，并发生链置换DNA合成。从FIP延长的DNA链被替换并释放，释放的单链在其3′端形成环结构(结构3)。DNA合成以单链DNA为模板进行，BIP和B3引物按照上述的相同方式产生结构5，结构5两端具有环状结构(整体呈哑铃状结构)；C：循环扩增阶段。使用自身结构作为模板，从3′端F1区开始自引发的DNA合成，并且延伸从FIP与环结构中F2c区的单链结合开始。经过上述步骤，产生与结构5互补的结构7，并且结构5由类似于从结构5～7引出的反应的结构8产生。结构9和10分别由结构6和8制成，并且还制造更多的细长结构[8]。(彩图见图版二)

表1对上述核酸扩增技术的参数及性能进行了概括，并分析比较了各自的优缺点。

表1 核酸扩增技术概括比较Table 1 Comparison of nucleic acid amplification techniques.

2 等温核酸扩增技术在病原体检测中的应用

核酸序列的检测在现代生物学和医学中是至关重要的，自20世纪90年代以来，这一领域开展的研究和成果呈指数级增长，并且在未来的几十年可能会持续增加[22]。病人样本中病原细菌、病毒和癌症基因的检测对于影响病人恢复起着至关重要的作用。聚合酶链式反应是使用最为广泛的DNA扩增的方法，用于检测和鉴定传染病、遗传病及其他方面的研究。由于PCR循环期间需要通过加热以解链双链，因此，PCR不适合用于检测活细胞中的核酸序列。等温核酸扩增技术，特别是可在细胞适宜温度(30～37℃)下工作的技术可以用于旨在了解活细胞中基因时序表达模式的相关研究。对于体外检测，有时有限的资源配置无法满足进行PCR测定的需求。由于上述PCR所具有的DNA/RNA检测分析中的局限性，促进了各种等温检测技术与平台的开发。在实际的病原体检测中，已有许多研究报道将等温核酸扩增技术应用其中[22]。

2.1 以DNA为遗传物质的病原体检测

大多数等温扩增技术能以极高的灵敏度扩增和检测DNA。在这些方法中，由于LAMP、HDA和RPA在序列扩增中的出色表现而被更为广泛的用于病原体基因组DNA的检测中。

结核病是一种乙类传染病，病死率约为12.5%。传统的临床检测方法需要涂布培养细菌，时间较长，而Motré等[23]利用HDA快速检测结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)，通过逐步优化引物和酶的用量，使得扩增2个拷贝的MTB基因组DNA的放大时间从60 min减少到30 min以内。该反应在65℃的恒定温度下进行，且不需要将模板进行热变性，使其成为真正的等温。同时，该方法使用无需仪器的自携式一次性纸盒即可实现检测，从而将交叉污染的可能性降至最低。因此，整个检测程序只需要一个便宜的加热块，适用于资源有限的地区。

沙门氏菌是一种主要的食源性病原体，在环境中普遍存在，并可导致严重的人畜疾病，传统的沙门氏菌检测方法费时费力。依赖嗜热解螺旋酶扩增(thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA)是一种较新的等温核酸扩增技术，该技术利用解旋酶在恒定温度下解链双链DNA，实现等温核酸扩增。Du等[24]将该技术与侧向流动测定相结合，开发了一种快速、简单和便携的沙门氏菌检测方法，可以在90 min内提供可视化的检测结果，适用于设备有限的地区。

快速、灵敏地检测大量样品中的低量病原体对于患者的早期诊断和治疗十分关键。Dao等[25]将RPA和微流体平台结合，开发了一种新型病原体富集平台。利用新平台检测10 mL含沙门氏菌尿液和含布鲁氏菌尿液的灵敏度分别比无富集过程的实时PCR高20倍和10倍。该技术通过提高对大样本中病原体的捕获效率来更好地诊断病原体，提高了对于致病DNA的检测极限，具有良好的应用前景。

早期诊断对于依赖种子传播的真菌病原体是十分重要的，从而可以避免病原体的繁殖，减少经济损失和不必要的杀菌剂的使用。传统的检测种子真菌的技术是基于孵化和成长，该方法虽然简单但是耗时，需要真菌学实验相关操作技能。最近，基于DNA分析的新鉴定技术已被应用，且由于其具有的高灵敏度和特异性，使其在应用中非常高效、实用。如LAMP已被广泛用于相关检测中。蔓枯病菌是一种引起葫芦科作物果皮枯萎的致病真菌，Yao等[26]开发了一种快速、直观和灵敏的LAMP分析方法，用于检测葫芦科作物中的真菌病原体。而黑穗病是一种在甘蔗种植区广泛流行的真菌病，Su等[27]利用LAMP开发的黑穗病真菌病原体检测方法的灵敏度比常规PCR检测方法高100倍。由于等温核酸扩增技术具有诸多优点，其在未来也可延伸用于种子中真菌病原体的检测。

HDA可以将复杂生物基质的目标序列(如粗细菌裂解液或血液)扩增106倍[14]，也可以用于检测多种目标序列，如基于大肠杆菌UvrD的HDA系统可以扩增来自幽门螺杆菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、齿密螺旋体、马来丝虫和人细胞的各种基因组DNA的靶序列[14]。最近，Andresen等[28]在芯片上实现了用HDA来进行DNA扩增，为该技术应用于临床快速检测提供了实际依据，同时也展现了HAD所具有的巨大潜力。

2.2 以RNA为遗传物质的病原体检测

目前，艾滋病在世界范围内广泛流行，对人类健康、经济发展和社会稳定都产生了严重的威胁。而快速、可靠地检测艾滋病毒感染有助于促进早期治疗，可显著提高治疗效果。重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，可以在不需要复杂设备的情况下，在20 min内快速扩增来自多种HIV-1亚型的原病毒DNA。同时，等温核酸扩增技术也适用于以RNA为遗传物质的病原体检测。Lillis等[29]将逆转录酶和RPA相结合(RT-RPA)，用于检测HIV-1病毒RNA及其前病毒的DNA，这种RT-RPA HIV-1检测方法的检测限为10～30个确切序列匹配的DNA或RNA拷贝，是一种新型的、可以快速、准确诊断HIV的高度敏感的工具，同时也适用于诊断婴儿HIV。

严重急性呼吸系统综合症(SARS)呈现出死亡率高、蔓延速度快的特点，且其临床表现不明确，没有已知的治疗或预防方法，这些因素强调了对其进行早期诊断的必要性。Keightley等[30]进行了SARS-CoV的实时依赖核酸序列扩增(NASBA)的测试，设计了许多引物/信标组以针对SARS-CoV基因组的不同区域，并进行了敏感性和特异性检测，发现N目标序列始终比Pol目标序列更为敏感。目前，多靶实时NASBA检测已被成功开发，并用于SARS-CoV的敏感检测。

为了快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus，HP-PRRSV)2型，Yang等[31]开发了一种基于荧光探针的实时逆转录重组酶聚合酶扩增(real-time RT-RPA)的测定方法，通过在反应体系中加入荧光探针使结果可视化。实时RT-RPA可高特异性地扩增HP-PRRSV，与经典PRRSV、经典猪瘟病毒、伪狂犬病病毒和口蹄疫病毒无交叉反应。

2.3 其他类型的病原体检测

阿米巴病被列为世界上10种最常见的寄生虫病之一。传统的显微镜检查法、培养法操作时间长、技术要求高，且检出率低，而抗原检测法虽然更为准确，但有些情况下还是会发生检测遗漏[32]。Nair等[33]开发了一种利用重组酶聚合酶扩增特异性检测溶组织内阿米巴的方法，由于其成本低、灵敏度高、适用于现场诊断，使其具有更高的可用性，有助于在流行地区快速诊断和治疗阿米巴病。

Doseeva等[34]阐述了用于检测沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，CT)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhea，NG)的4重tHDA测定的发展和优化。该测定方法显示出较高的CT/NG同时检测分析的灵敏度和特异性，且与各种样品类型、培养基兼容，同时，测定中使用的等温反应条件和均相终点检测非常适用于实验室自动化、高通量筛选应用以及即时测试(point-of-care testing)。

立克次体病是一类威胁人类健康的人兽共患病，其病原体均可通过媒介昆虫与动物宿主之间进行传播，导致流感样症状。诊断感染立克次体的标准是间接免疫荧光试验，但这是一种血清学方法，不适用于疾病急性期的病原鉴定。针对这一问题，Kissenkötter等[35]开发了一种快速、无限制的方法来检测所有感染立克次体的物种。以23S和16S rRNA基因作为RPA的扩增序列，10个以内的目标序列拷贝可以在7～10 min内检测出来。这种RPA分析方法可在移动手提箱实验室中实施，以方便偏远农村地区使用，也为家庭自助式疾病检测提供了可行的方法。

表2分析比较了不同等温核酸扩增技术应用于病原体检测的优缺点。

表2 不同等温核酸扩增技术应用于病原体检测比较Table 2 Comparison of isothermal amplification techniques detecting pathogen.

3 展望

在过去的二三十年里，多种在等温条件下即可实现扩增的核酸检测技术取得了长足发展[36]。其中多种方法已被证实可用于扩增模板量极少的序列，并在临床检测中展现出巨大的潜力。

随着生物、化学、纳米材料等研究的不断深入，等温检测也从中获益，检测目标已经从DNA/RNA扩大到细胞、蛋白质、小分子甚至离子。此外，研究人员充分证明了这些方法也可应用于测序、原位标记和细胞内生物成像等领域，更有研究表明使用等温扩增方法产生的扩增子可用于构建通用的核酸纳米材料[37]，这显示出其在生物医学生物成像和生物传感等方面也具有广阔的应用前景[38～42]。最近，研究人员发现，加入生长增殖由DNA分析物触发的微生物，可降低可视化的核酸诊断试剂的成本[43]，这为等温核酸扩增技术广泛应用于病原体检测提供了有利条件。此外，将等温扩增集成到微系统或便携式设备中，促进了基于核酸的POC诊断技术的发展，大量研究表明，现有的等温核酸扩增技术可表现出与基于PCR的分析相媲美、甚至更好的性能[44]。随着溶液系统复杂度的降低，相关诊断设备和试剂盒已逐渐走向市场，并已开发出多种商业化产品。

不仅限于上文所涉及到的几种等温核酸扩增技术，其他技术在病原体检测中也有重要的应用。到目前为止，已将滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)整合到芯片中。Reiss等[45]在流通系统中进行RCA，可以在荧光显微镜下观察扩增产物。此外，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Alere公司发布了一种基于粘连和延伸扩增反应(nicking and extension amplification reaction，NEAR)的检测试剂盒，可在15 min内检测到A型和B型流感病毒，总成本约为40美元。

然而，现有的等温核酸扩增技术用于病原体检测中，仍存在以下问题：①核酸指数扩增的过程中存在放大偏差和非特异性扩增，这对模板基因组的有效浓度提出了更高的要求；②尽管便携式POC诊断设备的商业产品已经面世，但其集成技术仍存在较大的进步空间(如基于试纸或微流控芯片的检测平台需要控制无溶剂的反应环境，尚无法实现)，其改进依赖于工程、物理和生物科学的进一步发展。

总而言之，等温核酸扩增技术的良好性能有助于其与前一代非等温的核酸扩增技术(如PCR)进行竞争，并可广泛应用于样品检测。这些方法的简便性、恒温性以及对小型化与自动化的高度适应性，在开发可用于临床或现场检测的手持式DNA诊断设备中展现出巨大潜力。