遗传和环境因素对青少年脑灰质容积和皮层厚度影响的双生子研究☆

马兴顺 王娜 李睿博 胡小梅 张晓薇 邓伟 唐金香 彭亚东 康林娥贺越 李晓 侯枭 傅一笑 蒙华庆 李涛

精神疾病有明确的遗传基础[1-2]，又与脑功能和脑结构存在密切相关性。由于青少年处于脑结构与功能发育的关键时间段，研究这一时期正常脑结构发育对于脑功能及精神疾病的机制探索尤为重要[3]。脑结构研究指标包括脑容积、皮层面积、皮层厚度以及脑回曲率等，许多研究表明脑容积和皮层面积是脑发育过程的重要形态生物学指标[4-6]。不同于皮层厚度，皮层面积测量指标在脑容积计算中占很大比重[7-9]，而且研究证明皮层面积和皮层厚度这两种常用的脑测量指标各自拥有独立的基因表达系统[10]。我们之前研究提示青少年脑皮层面积扩张系由遗传因素控制，而受环境因素干扰相对较少[11]。本研究进一步拓展，用双生子研究方法探索遗传因素对青少年灰质容积、皮层厚度的影响特点。

1 对象与方法

1.1 研究对象 经重庆市教育委员会及所辖各中小学校授权获得双生子资料，募集青少年在校双生子68对。纳入标准：①12～18岁；②无躯体疾病、精神疾病及认知功能障碍；③经韦氏儿童智力量表测评,智力（intelligence quotient，IQ）≥80。 排除标准：头颅MRI T1影像图像模糊。最终纳入57对双生子（114名个体）。本研究经重庆医科大学伦理委员会批准。所有受试者本人及其法定监护人签署书面知情同意。

1.2 利手与智力评估 利手调查采用英文版爱丁堡利手问卷；智力评估采用由龚耀先等于1993年修订的中国修订版韦氏儿童智力量表。

1.3 脑影像数据收集与处理 对所有受试者进行头颅磁共振扫描。使用重庆医科大学附属第一医院GE 3.0 T磁共振成像系统获得高分辨T1加权图像，用8通道头线圈提高信噪比。受试者的3D T1图像通过3D梯度回波序列获得，扫描参数如下：回波时间（echo time，TE）为 2.8 ms，重复时间（repetition time，TR）为 6.2 ms，层厚为 1.2 mm，翻转角为 25°，视野（fieldofview，FOV）为 24 cm×24 cm，矩阵为256×256，体素大小为0.47 mm×0.47 mm×1 mm，每名受试者全脑共采集166层矢状位图像。

大脑皮层重建计算使用Freesurfer_5.3.0软件包[12-15]，该软件包用系列设置的工具调用FSL影像软件将被试T1加权像图像数据进行自动处理。具体过程：①非均匀性校正磁场强度和去除颅外组织；②通过一连续性设置组件计算，对图像进行初步分割；③对灰白质表面进行高斯半峰全宽平滑，平滑核大小10 mm×10 mm×10 mm。

每名被试图像以Desikan-Killiany脑图谱为模板在原始空间进行分割，皮层表面最终被分割为66个感兴趣的脑区[12,16]。通过Freesurfer软件计算分割出66个脑区各区的灰质容积、皮层厚度具体值，再次依据Desikan-Killiany脑图谱重新计算双侧额叶、顶叶、枕叶、颞叶及扣带回共计10个分区的灰质容积、皮层厚度。

1.4 双生子卵型鉴定 所有受试者用K2EDTA抗凝管采静脉血4 mL，-30℃冰箱速冻后送四川大学华西医院精神卫生实验室提取DNA。采用AmpFLSTRIdentifilerPCR Amplification Kit试剂盒 （ABI公司）检测15个短串联重复序列（short tandem repeat,STR）位点（D8S1179，D21S11，D7S820，CSF1PO，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539，D2S1338，D19S433，vWA，TPOX，D18S51，FGA，D5S818）及牙釉蛋白基因（Amelogenin）进行卵型鉴定（仪器Genetic Analyzer 3100AvantTM）。该方法鉴定分析同卵双生子（monozygotic twins，MZ）的可靠性可以达到0.999[17]。

1.5 统计学方法 统计分析使用OpenMx_1.3.2-2301软件包[16]，运行环境为统计软件R-2.15.2[17-18]。应用双生子结构方程式模型估计加性遗传因素（additive genetic factor,A）、 共享环境因素（common or shared environmental factor,C）以及特异性/非共享环境因素（unique or unshared environmental factor,E）对表型（脑灰质容积、皮层厚度）总方差的贡献程度，此模型的统计误差包含在特异性环境因素（E）中[19-20]。用原始数据构建单变量双生子模型来估计在脑叶水平10个区域中，影响脑灰质容积、皮层厚度的遗传和环境因素分别所占比重（图 1），采用最大似然法在起始模型（ACE）和其子模型（AE、CE和E）中选择最佳模型[19-21]。检验水准 α=0.05。

图1 单变量双生子结构方程模型的示意图，分析区域脑容积、皮层厚度受遗传和环境因素影响程度。A为加性遗传因素（additive genetic variance,A）；C 为共享环境（shared environmental variance,C）；E为特异性环境因素（unique environmental variance,E）。G为各脑区灰质容积或皮层厚度的表型方差。a、c、e分别为路径系数

2 结果

纳入57对双生子，其中同卵双生子30对，异卵双生子27对。同卵和异卵双生子性别和年龄分布无统计学差异（P＞0.05），见表1。所有纳入双生子均为右利手。

对所有受试者10个脑区灰质容积、皮层厚度逐个构建饱和模型 （saturated model）及子模型（submodel），10个脑区灰质容积、皮层厚度的饱和模型和其子模型差异无统计学意义 （P＞0.05），样本同质性较好，具有群体代表性。另外各脑区灰质容积、皮层厚度的饱和模型与起始模型（ACE）亦不存在统计学差异（P＞0.05），故可以进一步构建单变量ACE模型及其子模型AE、CE和E。

翠姨越来越瘦了，哥哥去到外祖母家看了她两次，也不过是吃饭，喝酒，应酬了一番。而且说是去看外祖母的。在这里年青的男子，去拜访年青的女子，是不可以的。哥哥回来也并不带回什么欢喜或是什么新的忧郁，还是一样和大家打牌下棋。

表1 青少年双生子性别及年龄分布

2.1 灰质容积遗传和环境因素分析结果 双生子结构方程示，对于灰质容积，双侧扣带回和右侧枕叶遗传度在ACE模型中无统计学意义 （PNOA＞0.05，ACE与AE模型以及AE与E模型比较），其他脑区灰质容积遗传度均有统计学意义 （PNOA＜0.05，ACE与AE模型以及AE与E模型比较），而共享环境因素（C）贡献度均较低或者接近于零，且无统计学意义（PNOC＞0.05，ACE与CE模型比较），特异性环境因素 （E）贡献度也较低；各个脑区ACE模型与AE模型差异无统计学意义 （均P＞0.05），提示共享环境因素对各区灰质容积影响可以忽略，E模型与 ACE模型 （P＜0.01）、AE模型（P＜0.01）比较差异均有统计学意义，故最佳模型为AE。在最佳模型AE中，各脑区灰质容积遗传度均有统计学意义（PNOA＜0.01，ACE与AE模型以及AE与E模型比较）。在ACE和AE模型中，额、顶、颞、枕、扣带回灰质容积表型遗传度依次降低。见表2。

2.2 皮层厚度遗传和环境因素分析结果 皮层厚度在ACE模型中各区大部分遗传度均不高，除双侧扣带回及右侧额叶（PNOA＜0.05，ACE与AE模型以及AE与E模型比较），其他脑区遗传度无统计学意义（PNOA＞0.05，ACE与 AE模型以及 AE与 E模型比较）。相比较各区皮层厚度的遗传度（A）及共享环境因素（C）贡献度与特异性环境因素（E），后者贡献度明显上升。大部分区域ACE模型与AE模型比较无统计学差异（PNOA＞0.05，除双侧扣带回及右侧额叶PNOA＜0.05），各区域ACE模型与CE模型均无统计学差异（PNOC＞0.05），但大部分区域ACE模型与E模型比较差异有统计学意义（PNOAC＜0.05，除右侧颞叶、枕叶、扣带回PNOAC＞0.05），提示尽管大部分区域皮层厚度遗传度和共享环境因素贡献度均低，但不能同时忽略不计，因此最佳模型为ACE。见表3。

3 讨论

在脑叶水平，本研究以青少年为对象获得的结果与成人双生子研究一致[22]，即遗传因素对青少年脑灰质容积影响呈绝对优势。以往关于抑郁症和精神分裂症患者的研究发现其脑区容积有明显改变[23-25]，而抑郁症和精神分裂症是高度遗传的精神疾病，故脑容积改变与精神疾病可能有共同的遗传基础，即遗传因素既影响脑容积改变又影响脑功能改变。皮层厚度分别受遗传因素[26-27]、共享环境因素、特异性环境因素共同影响。我们之前关于青少年脑皮层面积的双生子研究发现，相同脑区的皮层面积、灰质容积、皮层厚度遗传度依次下降，尤其皮层厚度遗传度下降更为明显，而皮层厚度的特异性环境因素贡献度明显上升[11]，这提示青少年在脑认知功能发育和训练时脑的可塑性变化在这3个结构指标中可能主要体现在皮层厚度改变。文献研究也发现儿童青少年认知发育与左侧脑半球皮层厚度变薄相关[28]。最近研究提示同卵双生子接受音乐训练会使左侧半球听觉神经网络拥有更大的皮层厚度[29]，而这种可塑性变化可能也体现在疾病之中[30]。有研究表明特异性环境因素在双相情感障碍中扮演重要角色，这类患者脑皮层发生改变，尤其以皮层厚度变化最为明显[31]。当然由于在双生子结构方程模型中E除含有特异性环境因素外，还包含有误差，因此皮层厚度受特异性环境因素E影响大的研究结果也可能是系统误差所致。

表2 10个脑区灰质容积在ACE和AE模型中各参数贡献度及模型比较结果

表3 10个脑区皮层厚度在ACE和AE模型中各参数贡献度及模型比较结果

由于灰质容积计算依赖于皮层面积与皮层厚度，本研究发现皮层厚度受遗传因素影响较小，故推测遗传因素对容积的影响主要驱动因素依赖于皮层面积扩张，而非皮层厚度；由于皮层厚度受环境因素影响较大，这使得相同区域灰质容积遗传度并没有皮层面积高，三者比较皮层面积是更接近于遗传的表型。

本研究纳入双生子研究青少年大脑分区灰质容积、皮层厚度受遗传和环境因素作用的特点，在基因与脑结构关系研究、脑结构与脑功能关系研究及脑功能遗传学研究中可能存在应用价值。

另外本研究亦有不足之处：①因小样本双生子研究，分组没有考虑性别因素，因此结果是否存在性别差异是未知的；②小样本统计不能发现较小的影响，此前皮层面积研究发现大部分区域共同环境因素影响几乎可以忽略不计，故吸取之前经验，在此次研究中并未进一步探讨66个脑区灰质容积、皮层厚度的结果；③研究中区域面积分割是以传统的D-K脑图谱为模板，该图谱非基于遗传图谱，分割带有一定强制色彩。故研究的不足也指导在进一步研究需要绘制不同指标基于遗传的脑图谱，并且，应考虑对不同种族、年龄段、性别等进行独立分析研究。