积雪草酸对原代大鼠视网膜神经节细胞低氧损伤的保护作用研究△

胡方园 黄婉静 吴继红 陈君毅

青光眼视神经病变是全球范围内第1位不可逆性致盲眼病，在全球致盲人群中占21%，预计到2040年全球青光眼患者可高达1亿人。青光眼是以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡及其轴突退变为病理基础的进行性神经退行性眼病[1]。RGC的视神经保护一直是青光眼研究领域的热点和难点，深入探索RGC有效的保护剂，将有利于为青光眼临床治疗提供有效的靶向药物，阻断视神经的进行性损伤。此外，视网膜是代谢旺盛的神经组织，其血供特点是视网膜血管没有侧支循环代偿，尤其是视网膜内5层神经组织仅受视网膜血管系统供血。因此，当发生视网膜血管系统血供障碍时，视网膜神经组织缺血、缺氧，特别是RGC及其轴突极易受到损伤。有研究[2-3]表明，积雪草酸(asiatic acid，AA)在神经系统中可以抵抗缺血、缺氧等因素造成的神经细胞凋亡，发挥有效的神经保护作用，但在青光眼及视网膜视神经缺血、缺氧等疾病中的作用还鲜见报道。还有研究[4]表明，在神经系统疾病中，凋亡相关蛋白c-Abl作为关键的凋亡调控分子，在细胞凋亡过程中发挥重要效能。本文就AA在原代RGC低氧刺激所致凋亡中的保护作用及其对c-Abl的调控作用进行实验研究探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 出生1～3 d的新生SD大鼠，由我院实验动物中心提供，饲养环境良好。

1.1.2 主要试剂 Neurobasal培养基(Thermo)，木瓜蛋白酶(Worthington)，卵类黏蛋白(Sigma-Aldrich)，DNase Ⅰ(Sigma-Aldrich)，转铁蛋白(Sigma-Aldrich)，黄体酮(Sigma-Aldrich)，腐胺(Sigma-Aldrich)，硒(Sigma-Aldrich)， T3(Sigma-Aldrich)，T4(Sigma-Aldrich)，B27(Invitrogen)，丙酮酸钠(Gibco)，谷氨酰胺(Gibco), N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich)，胰岛素(Sigma-Aldrich)，毛喉素(Sigma-Aldrich)，脑源性神经营养因子(PeproTech)，睫状神经营养因子(PeproTech)，碱性成纤维细胞生长因子(PeproTech)，Thy1.1抗体(Santa Cruz)，抗巨噬细胞抗体(Santa Cruz)，c-Abl抗体(Santa Cruz)，p-c-Abl抗体(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 Thy1.1抗体包被法纯化RGC 选取出生1～3 d的新生SD大鼠，解剖游离出视网膜，经木瓜蛋白酶溶液37 ℃消化30 min后，加入蛋白酶抑制剂(0.1% 牛血清白蛋白, 0.1%卵类黏蛋白，1% DNase Ⅰ)终止消化，吹打成单细胞悬液。将获取的单细胞悬液缓慢加入已包被好抗巨噬细胞抗体(50 mmol/L，pH=9.5，Tris-HCl稀释)的细胞培养皿中，37 ℃静置1 h，视网膜中的巨噬细胞被吸附到培养皿底部；吸取培养液上清液缓慢加入已包被好抗Thy1.1抗体(50 mmol/L，pH=9.5，Tris-HCl稀释)的培养皿中，37 ℃静置1 h，弃细胞培养基上清液，黏附到培养皿底部的细胞即是RGC群。获取的RGC群接种在包被有多聚赖氨酸以及层粘连蛋白的培养皿中，加入RGC培养基(Neurobasal培养基包含0.1 mg/mL 牛血清白蛋白, 0.1 mg/mL 转铁蛋白，60 ng/mL 黄体酮, 16 μg/mL 腐胺, 40 ng/mL 硒, 40 ng/mL T3, 40 ng/mL T4, 20 μL/mL B27，1 mmol/L 丙酮酸钠，2 mmol/L 谷氨酰胺, 5 μg/mL N-乙酰-L-半胱氨酸, 5 μg/mL 胰岛素, 5 μmol/L 毛喉素, 50 ng/mL 脑源性神经营养因子, 10 ng/mL 睫状神经营养因子, 10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子, 100 U/mL 抗生素)，于37 ℃ 5% CO2条件下培养，每2 d给予半换液处理。

1.2.2 RGC纯度鉴定 经Thy1.1抗体包被筛选方法获取的阳性RGC群，抽提总RNA，反转录成cDNA，随后以定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测RGC以及其他类型细胞的Marker表达水平。RGC特异性Marker包括Thy1.1、Tuj1、Brn3a及Brn3b；其他视网膜细胞Marker包括胶质细胞原纤维酸性蛋白、巨噬细胞CD68及无长突细胞Syntaxin。

1.2.3 TUNEL细胞凋亡检测 低氧条件下(1%O2)，给予原代RGC不同时间(0、12、24、48 h)的低氧刺激，TUNEL凋亡试剂盒检测RGC凋亡。给予原代RGC不同浓度(0、5、10、20、50 μmol/L)的AA预处理2 h后，1% O2处理48 h，TUNEL凋亡试剂盒检测RGC凋亡。

1.2.4 CCK-8细胞活力检测 RGC接种于96孔板中，每孔接种3×104个细胞，同时设置空白孔(只加培养基)，去除酚红对吸光度的影响。2 d后，待RGC生长良好时，分别加入0、5、10、20、50 μmol/L的AA预处理2 h后，1% O2处理48 h， CCK-8检测RGC的存活率。

1.2.5 Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统 收集不同处理组的细胞，提取总蛋白；Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测c-Abl和p-c-Abl的蛋白表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS统计软件，实验数据均以平均值±标准差表示，定量资料比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SD大鼠原代RGC培养及纯度鉴定 利用Thy1.1抗体包被法纯化获取的RGC在体外培养2 d后，显微镜下观察其生长状态良好(图1A)。采用qPCR检测Thy1.1抗体包被法分选的RGC纯度，与non-RGC群相比，分选出的RGC群中神经节细胞特异性标志物Thy1.1、Tuj1、Brn3a、Brn3b的表达水平均显著高于non-RGC群；而其他细胞类型的标志物GFAP、Syntaxin、CD68则明显低于non-RGC群(图1B)。与之相反，non-RGC群中神经节细胞特异性标志物的表达均低下。

图1. 大鼠原代RGC纯度鉴定 A.显微镜下观察RGC生长情况(100×)；B.qPCR检测原代RGC纯度

2.2 低氧条件下原代RGC的凋亡特征 以体外低氧条件(1% O2)模拟青光眼及视网膜缺血性损伤因素，给予原代RGC不同时长(0、12、24、48 h)的低氧刺激，TUNEL检测RGC的凋亡情况，0、12、24、48 h低氧刺激组的凋亡细胞数分别为23.000±3.606、74.500±5.500、125.000±5.000、180.000±10.000(图2)，随着低氧刺激时间的递增，RGC的TUNEL凋亡细胞数呈梯度升高，与正常氧培养相比，差异具有统计学意义。

2.3 AA对原代RGC低氧损伤的保护作用 低氧刺激下(1%O2，48 h)，TUNEL检测AA干预后RGC的凋亡情况(图3)，低氧刺激时，TUNEL凋亡阳性细胞数与正常氧条件相比明显增加(P<0.01，2组凋亡细胞数分别为38.000±5.000、175.500±5.500)；给予不同浓度(0、5、10、20和50 μmol/L)的AA处理后，凋亡细胞数依次为122.000±3.000、69.000±6.000、42.000±3.000、118.000±8.000，RGC的凋亡细胞数在10 μmol/L与20 μmol/L AA干预时显著减少(P<0.01)。同时CCK-8检测低氧条件下RGC的细胞活力，低氧条件下(1%O2，48 h)，RGC的存活率明显低于正常氧培养条件(P<0.01)；加入不同剂量的AA后，RGC的存活率同样在10 μmol/L与20 μmol/L AA干预时升高， 结果表明AA在低氧条件下可以抑制RGC的凋亡，促进其存活(图4)。

图2. TUNEL检测RGC凋亡情况 A.给予原代RGC不同时长低氧刺激后，荧光显微镜下观察TUNEL染色结果(100×)；B.TUNEL阳性细胞数的统计，阳性细胞数与正常氧条件(0 h)相比，3组不同低氧刺激时间的凋亡阳性细胞数均显著增加(＊＊示P<0.01，＊＊＊示P<0.001)

图3. TUNEL检测RGC凋亡情况 A.给予AA预处理后，低氧(1%O2)条件下培养48 h，荧光显微镜下观察TUNEL染色结果(100×)；B.TUNEL凋亡细胞数统计，常氧条件与低氧条件下的凋亡细胞数差异具有统计学意义(＊＊示P<0.01)；不同浓度AA干预后与低氧条件相比，凋亡细胞数显著减少(＊示P<0.05，＊＊示P<0.01)

图4. CCK-8检测RGC增殖活力 与正常氧条件相比，低氧刺激(1%O248 h)后，RGC细胞活力明显下降(＊＊示P<0.01)；给予10 μmol/L与20 μmol/L AA干预后，可以促进RGC的增殖能力(＊示P<0.05，＊＊示P<0.01)

2.4 AA通过调控c-Abl信号分子保护原代RGC的低氧损伤 体外低氧(1%O2)刺激原代RGC后，利用Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测c-Abl总蛋白及磷酸化蛋白表达水平。原代RGC给予不同时间的低氧刺激后，磷酸化c-Abl的蛋白表达水平呈时间梯度性增加(图5A)，表明c-Abl的磷酸化激活与RGC凋亡相关，可能参与调控RGC的凋亡。

体外给予原代RGC 20 μmol/L AA干预，1%O2处理48 h后，Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测蛋白表达。AA可以显著抑制低氧条件下c-Abl的蛋白磷酸化水平(图5B)，结果表明AA可以通过抑制c-Abl的磷酸化激活减少原代RGC的凋亡，促进其存活。

图5. Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测蛋白表达 A.不同时间的低氧刺激下(1%O2)，c-Abl总蛋白及磷酸化蛋白的表达情况；B.AA干预后，观察常氧条件以及低氧条件下的c-Abl总蛋白及磷酸化蛋白表达水平

3 讨论

青光眼及视网膜视神经缺血性疾病是一种多因素引起的视神经病变，主要包括氧化应激损伤、高眼压机械损伤、缺血/再灌注损伤、线粒体功能异常、神经营养因子的剥夺、胞内Ca+毒性、谷氨酸盐神经毒性以及自身免疫因素等，但无论哪种病理性因素，最终共同的结局均是RGC的凋亡、进行性丢失，并且具有不可逆性[5]。多年来对于这些眼病的视网膜视神经保护研究主要靶向于抑制RGC的凋亡，但未有突破性成果。因此，探索RGC有效的保护药物具有重要意义。

AA是一种存在于天然产物中的五环三萜类化合物，具有很强的抗氧化作用，可有效清除氧自由基，同时还兼具抗炎症、舒张血管的特性[6]。体外研究[3,7-8]表明，在H2O2、鱼藤酮、神经酰胺以及谷氨酸的损伤刺激下，AA可有效抑制神经细胞的凋亡。在谷氨酸诱导的脑损伤小鼠模型中，AA干预后可有效改善小鼠的记忆功能[7]。此外，脑缺血-再灌注损伤动物模型中，AA也具有很好的神经保护作用[9]。综上所述，无论是体外还是体内动物模型中，AA都可以很好地发挥抗氧化作用，清除氧自由基，促进神经细胞的存活。AA在青光眼以及视网膜缺血性疾病中的作用尚罕见报道。本实验探讨了AA在原代RGC缺氧损伤中的保护作用。实验结果表明，低氧刺激下原代RGC的凋亡细胞数明显增加。而AA干预后，TUNEL实验结果显示低氧条件下RGC的凋亡阳性细胞数明显减少；并且细胞增殖实验结果表明AA干预后RGC的细胞活力明显升高。以上实验结果证实AA可有效抑制低氧损伤中原代RGC的凋亡，促进其存活。此外，我们还初步探讨了AA抗RGC凋亡的分子机制。

c-Abl作为非受体酪氨酸激酶家族中的成员之一，广泛表达于细胞中，在细胞凋亡信号通路的调控中发挥重要效能[10]。研究[4, 11-12]表明，在神经系统变性疾病中，c-Abl在神经元的损伤中发挥重要作用。在MPTP诱导的帕金森病动物模型中，c-Abl的磷酸化水平明显升高，通过增强与P38α的相互作用促进P38α的磷酸化，从而导致神经元的死亡[4]。此外，AβO诱导的阿尔兹海默病模型中，c-Abl的活性明显增加，进一步通过提高HDAC2的活性，激活CDK5/GSK3β信号通路来抑制神经元相关基因的转录表达以及促进神经元的凋亡[11-12]。综上所述，c-Abl作为关键的凋亡调控分子在神经变性疾病中发挥重要作用，但是在RGC损伤中罕见报道。本实验研究结果表明，给予原代RGC不同时间的低氧刺激后，RGC发生凋亡，磷酸化c-Abl的蛋白表达水平呈时间梯度性增加，表明c-Abl的磷酸化激活与RGC的凋亡密切相关。给予AA干预后，发现AA在抑制RGC凋亡的同时，可以显著下调磷酸化c-Abl的表达水平，初步证实AA通过调控c-Abl的激活在RGC凋亡中发挥重要作用。

综上所述，AA通过抑制c-Abl的磷酸化激活在大鼠原代RGC的低氧损伤中发挥保护作用。据此研究结果，后续可在动物模型内进一步做有效性和安全性研究，有望为青光眼及视网膜视神经缺血性病变的神经保护治疗提供新的候选药物。