吡咯烷二硫代氨基甲酸酯治疗急性胰腺炎大鼠的效果及其作用机制

王艳娥

(武汉市中心医院，湖北 武汉 430000)

重症急性胰腺炎(SAP)病理过程开始于胰腺腺泡细胞的破坏，细胞因子学说认为胰腺腺泡细胞被破坏后，病变处细胞因子大量释放，进入体循环，进而诱发全身炎症反应综合征〔1〕。研究〔2〕发现左旋精氨酸诱导的急性胰腺炎(AP)发病机制与核因子(NF)-κB活化、氧化应激有关。 NF-κB活化发生核移位与相应靶 DNA结合诱导，从而加重胰腺炎的临床症状。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)是一种重要的抗氧化剂，可通过抑制NF-κB通路抑制κB蛋白降解，进而达到阻止NF-κB活化核移位过程〔3〕。研究〔4〕发现重要的晚期炎症因子参与了脓毒症的病理过程，并且有望成为治疗SAP的新靶点； 高迁移率蛋白(HMG)B1是一类被证实与SAP具有重要关系的非组核蛋白，但相关机制还不明晰。本研究探讨PDTC治疗AP大鼠的效果及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取SPF级SD大鼠72只，雌雄不限，平均(210±6.4)g，喂养于23～25℃、光照12 h、相对湿度45%～60%的环境中，自由进食进水。

1.2实验药品、仪器 PDTC、5%牛黄胆酸钠购于Sigma公司；NF-κB、HMGB1一抗、二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购于南京建成生物研究所；Western裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、电化学发光(ECL)液、酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于南京凯基药物有限公司；酶标仪购于美国BD公司。

1.3实验分组与造模 SPF级SD大鼠72只随机分为假手术组、模型组、PDTC组各24只，术前12 h禁食，腹腔注射2%戊巴比妥钠60 mg/kg麻醉；以上腹正中为切口，5号皮试针于十二指肠乳头附近肠壁上戳一小孔，改用另5号皮试针置入肠腔，经乳头探入胆胰管内，用显微血管夹分别夹闭肝门部胆管和胆胰管穿刺针处；匀速0.05 ml/min注射5%牛黄胆酸钠1 ml/kg，见胰腺组织充血水肿、点片状出血后，撤血管夹，缝合肠壁穿刺孔，关腹。术后皮下注射生理盐水20 ml/kg复苏、分笼安置。假手术组只行经乳头胆胰管穿刺而不注射任何药物〔5〕。

1.4干预方法 PDTC组于建模前腹腔注射30 mg/kg的PDTC，假手术组和模型组给予等量的生理盐水。

1.5胰腺组织HE染色 取各组胰腺组织，10%甲醛固定过夜，脱水后石蜡包埋并切片，脱蜡后梯度酒精脱水、苏木素-伊红染色，晾干、树胶封片，显微镜下观察组织结构情况〔6〕。

1.6ELISA法 大鼠心脏取血3 ml，离心后分离血清，酶标仪ELISA法检测丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL)-1、淀粉酶(AMY)水平，实验操作严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.7Western印迹法 蛋白裂解液提取胰腺组织核蛋白以检测NF-κB活性；蛋白裂解液提取胰腺总蛋白以检测HMGB1水平；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转至PAGE膜并用5%脱脂牛奶室温2 h封闭，分别加入一抗后4℃过夜，次日Tween-20 Tris盐酸缓冲液(TBST)漂洗5次后滴加羊抗兔二抗1 h室温孵育后ECL化学显影〔7〕。

1.8统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，t检验。

2 结 果

2.1各组胰腺组织病理学观察 假手术组可见胰腺组织结构清楚、未发现结构破坏、炎症细胞浸润等；模型组胰腺组织水肿明显，小叶间隙增大，胰腺组织中存在大量的红色渗出物，腺泡肿胀，镜下检查可见坏死病灶，坏死病灶区域内腺泡结构紊乱，细胞核发生凝固、坏死、溶解、细胞膜破裂；PDTC组胰腺组织的病变程度较模型组病变更轻，但是较假手术组显著加重。见图1。

2.2各组血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平比较 造模后24、48及72 h，模型组、PDTC组血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均显著高于假手术组(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC组血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均显著低于模型组(P<0.05)；见表1。

图1 各组胰腺组织HE染色情况(HE，×400)

指标组别24 h48 h72 hHMGB1(μg/ml)假手术组1.21±0.201.26±0.191.23±0.23模型组2.67±0.771)3.81±0.931)3.92±0.871)PDTC组1.63±0.341)2)1.78±0.501)2)1.94±0.481)2)MDA(nmol/ml)假手术组11.42±2.0111.85±1.9311.62±2.20模型组32.72±5.591)36.81±6.201)39.94±5.131)PDTC组22.18±4.201)2)25.94±5.771)2)20.76±5.381)2)IL-1(ng/ml)假手术组258.2±38.6262.7±41.9256.1±43.0模型组596.8±94.21)941.6±148.61)990.8±159.31)PDTC组392.1±77.61)2)438.2±89.51)2)411.3±73.41)2)AMY(U/L)假手术组114.3±18.4116.0±21.5117.2±19.5模型组339.2±59.11)287.6±52.81)238.6±42.51)PDTC组244.6±41.41)2)195.0±38.71)2)169.2±33.51)2)

1)与假手术组比较，2)与模型组比较：均P<0.05；下表同

2.3各组胰腺组织中NF-κB蛋白相对表达强度比较 造模后24、48及72 h，模型组和PDTC组胰腺组织中NF-κB蛋白相对表达强度均显著高于假手术组(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC组胰腺组织中NF-κB蛋白相对表达强度均显著低于模型组(P<0.05)；见表2。

表2 各组造模后不同时间胰腺组织中NF-κB蛋白相对表达强度比较

2.4各组胰腺组织中HMGB1蛋白相对表达强度比较 造模后24、48及72 h，模型组、PDTC组胰腺组织中HMGB1蛋白相对表达强度均显著高于假手术组(P<0.05)；造模后24、48及72 h，PDTC组胰腺组织中HMGB1蛋白相对表达强度均显著低于模型组(P<0.05)；见表3。

表3 各组造模后不同时间胰腺组织中HMGB1蛋白相对表达强度比较

3 讨 论

AP约20%可发展为SAP，而SAP并发症较多、病情凶险并具有较高的病死率，相关统计〔8〕显示目前SAP的总体病死率可达21%～35%。现阶段SAP伴多器官功能损伤的机制尚不明晰，研究〔9〕发现HMGB1在SAP大鼠中呈现高表达，并认为SAP的发生、发展可能存在HMGB1的参与。HMGB1由巨噬细胞分泌，是一类广泛存在于真核细胞内的非组核蛋白，其可作为晚期炎症介质参与脓毒症的病理过程，并预测HMGB1有望成为治疗SAP的新靶点。经过资料〔10，11〕总结认为HMGB1参与炎症反应主要有以下5种机制：①HMGB1能刺激单核/巨噬细胞、中性粒细胞表达释放多种炎症因子；②HMGB1的自身毒性作用；③HMGB1与其他炎症因子的相互促进作用；④HMGB1能增加上皮细胞的通透性；⑤HMGB1能促进内皮细胞的炎性反应，并破坏其屏障功能。

NF-κB是一类能与多种基因启动子部位的κB位点发生特异性结合的结合蛋白总称，亦是一类促进转录的DNA。 研究〔12〕发现TNF-α、IL-1等与SAP病程密切相关的炎症因子的基因启动部位均含有NF-κB位点，故而NF-κB对TNF-α的基因蛋白表达具有调控作用。但目前HMGB1基因启动子上是否存在κB的结合位点还不确定。故而，还无法肯定κB是否能调控HMGB1的表达。

本研究结果提示PDTC治疗AP大鼠能显著减轻炎症反应程度。这可能是因为PDTC抑制AP大鼠胰腺NF-κB的活化，进而降低了AP大鼠炎症因子的释放，从而减轻炎症反应和组织损伤。

本研究结果提示PDTC治疗AP大鼠能够降低胰腺组织中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表达。PDTC是一种含SH的强抗氧化剂，其容易进入细胞并在细胞内去乙酰化后生成半胱氨酸达到抗氧化作用〔13，14〕。PDTC抑制NF-κB活化的机制主要通过降低脂质过氧化物酶的活化，减少NF-κB抑制蛋白降解，从而抑制NF-κB活化；通过与巯基结合，降低NF-κB的DNA结合活性，从而降低胰腺组织中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表达，从而减轻炎症反应程度，起到保护胰腺的作用〔15〕。