硫化氢干预对小鼠心肌纤维化MAPK通路表达的影响

周 茜 张敏芳 任海燕 乔慧瑛

(苏州市吴江区第一人民医院老年医学科,江苏 苏州 215200)

心肌纤维化(MF)是指在心肌的正常组织结构中细胞外基质过量积聚，心脏组织中胶原浓度显著增高导致间质纤维成分增多或心肌细胞死亡从而被纤维组织替代〔1.2〕。硫化氢(H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的气体，在人体参与调节机体许多生理和病理过程，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用〔3，4〕。研究显示H2S可改善大鼠心肌纤维化，减少缺血再灌注相关的心律失常，可见H2S可改善心肌损伤〔5，6〕。心肌纤维化发生发展的过程均与丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活有关，本文探讨H2S是否影响心肌纤维化发生时MAPK通路。

1 材料与方法

1.1受试动物 BALB/c 雌性小鼠，体重18～22 g，6周龄，由新疆医科大学医学实验动物中心提供。使用实验动物依照3R原则，处理动物符合动物伦理学要求。

1.2心肌纤维化小鼠模型的制备 取BALB/c 雌性小鼠腹部皮下注射异丙肾上腺素，剂量50 mg/kg，2次/d，连续10 d。

1.3分组及给药 取正常BALB/c 雌性小鼠15只，连续腹部皮下注射生理盐水10 d，另取45只心肌纤维化小鼠，分为化模型组、H2S高和低剂量组。连续给药8 w。

1.4指标检测

1.4.1体表心电图 麻醉小鼠，行体表心电图分析。采用 Nihon Kohden ECG-6511 单道心电图机(上海光电)接上肢体导联，记录Ⅱ导联心电图。

1.4.2组织病理学 治疗后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，下腔静脉取血，分离血清待测。冰上分离心脏，称重，分2份，1份甲醛固定，石蜡包埋，切片，行HE染色，观察病理，1份-70℃备用进行Western印迹检测。

1.4.3Western印迹检测 JNK、ERK、p90RSK和p38磷酸化水平的表达加入1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液低温裂解5 min，离心得总蛋白。以二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度，电泳，上样，电转印，PBS-T室温封闭。应激活化蛋白激酶(JNK)(1∶1 000)、细胞外信号调节的蛋白激酶(ERK)(1∶1 500)、p90RSK(1∶800)、p38(1∶500)，GAPDH(1∶1 000)为内参；一抗孵育结束后，取出硝酸纤维素膜(NC膜)，放TBST于摇床洗涤，洗完进行二抗(1∶10 000)室温孵育1.0 h。在暗室中电化学发光(ECL)显色，曝光、条带半定量分析。

1.5统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行t及χ2检验，方差分析。

2 结 果

2.1各组体重、心脏重量和心脏系数比较 与正常组比较，模型组体重明显降低(P<0.05)，心脏重量和心脏系数明显增高(P<0.05)，与模型组比较，H2S组体重明显增高(P<0.05)，心脏重量降低和心脏系数明显降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表1。

2.2各组心电图比较 与正常组比，模型组ST段明显抬高(P<0.05)，H2S组ST段明显降低(P<0.05)，见图1。

2.3各组心肌病理学观察 正常组心肌细胞正常，模型组心肌细胞肥大、肿胀，变性，部分溶解或坏死，肌原纤维扭曲，断裂，炎性细胞浸润。H2S低剂量组大部分病灶均被吸收，少量炎症细胞浸润，增生的纤维组织和肌原纤维溶解，H2S高剂量改善明显，见图2。

2.4各组心肌JNK表达比较 与正常组比较，模型组JNK明显增高，与模型组比较，H2S组JNK明显降低，且呈剂量依赖性，见表2，图3。

表1 各组体重、心脏重量和心脏系数比较

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与H2S低剂量组比较：3)P<0.05，下表同

图1 各组治疗心电图比较

图2 各组心肌病理学观察(HE，×200)

组别JNKERKp90RSKp38正常组0.4±0.21.0±0.50.4±0.10.3±0.2模型组0.9±0.21)0.2±0.11)0.3±0.11)0.9±0.21)H2S低剂量组0.5±0.22)0.4±0.12)0.6±0.22)0.6±0.22)H2S高剂量组0.3±0.12)3)0.6±0.22)3)0.9±0.32)3)0.4±0.12)3)F/P值31.923/0.00022.581/0.00028.000/0.00032.308/0.000

2.5各组心肌ERK表达比较 与正常组比较，模型组ERK明显降低，与模型组比较，H2S组ERK明显升高，且呈剂量依赖性，见表2，图4。

2.6各组心肌p90RSK表达比较 与正常组比较，模型组p90RSK明显降低，与模型组比较，H2S组p90RSK明显升高，且呈剂量依赖性(均P<0.05)，见表2，图5。

2.7各组心肌p38表达比较 与正常组比较，模型组p38明显增高，与模型组比较，H2S组的p38明显降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表2，图6。

1～4：正常组，模型组，H2S低剂量组，H2S高剂量组，下图同图3 各组心肌JNK表达

图4 各组心肌ERK表达

图5 各组心肌p90RSK表达

图6 各组小鼠治疗后心肌p38磷酸化表达的比较

3 讨 论

心肌纤维化的病理机制较为复杂，涉及多种细胞信号通路引起细胞凋亡，其中MAPK 细胞信号途径是此过程中诱导心肌细胞损伤致凋亡中的一个重要调节枢纽，是多种细胞外信号引起细胞增殖、肥大和纤维化的细胞内信息共同通路〔7〕。动物研究也证实心肌纤维大鼠的MAPK活性显著高于同龄健康大鼠〔8〕。

MAPK通路容易被心肌纤维化、缺血再灌注损伤和细胞因子等刺激性病理因素激活。MAPK分为3 个亚族：ERK、JNK和p38〔9，10〕。其中，ERK 具有心肌保护作用。ERK 过度表达可抑制大鼠的心肌凋亡能力，激活的 ERK 信号级联可消除缺血再灌注损伤所致的心肌细胞损伤及凋亡。ERK 的下游效应器承担ERK的抗凋亡功能，如 ERK 能够直接磷酸化且激活 p90RSK，激活的 p90RSK能在线粒体顺序化磷酸化亲凋亡因子 Bad，保护细胞避免凋亡。JNK和p38蛋白激酶被激活后引起特定蛋白的表达或活性改变，参与细胞的基因表达、迁移、分化、凋亡和增殖调控作用，可导致多种器官的细胞凋亡。啮鼠动物的研究显示p38在缺血再灌注损伤的心肌细胞促凋亡方面具有关键作用，小鼠心肌缺血前给予p38的特异性抑制剂SB239063，可显著降低心肌梗死面积，但JNK在调节心肌细胞凋亡的效应仍存在争议，与JNK可调节不同细胞因子发挥促进或抑制细胞凋亡的作用〔11～13〕。由此可见，MAPK 信号转导途径的逐级激活可能是血管平滑肌细胞增殖和心肌纤维化的重要机制。

H2S对心肌保护作用受到关注，离体心肌梗死模型的研究显示，H2S可显著缩小梗死心肌面积并降低心肌梗死后死亡率，提示H2S可能对缺血缺氧心脏起着保护性作用。H2S对主动脉及肺动脉血管平滑肌细胞具有抑制增殖和促进凋亡的双重作用。对于体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞，内皮素可诱导其增殖并使MAPK活性增加，而H2S可剂量依赖性地下调MAPK从而抑制内皮素诱导的细胞增殖〔14～17〕。

本文显示，H2S能够抑制MAPK通路激活，即促进 MAPK的ERK 的活化和减少促凋亡通路JNK和p38通路的激活，起到减轻心肌纤维化的药效，具有明显的心肌靶器官保护作用，但课题仍存在一些问题：①JNK的抗心肌细胞凋亡的作用仍处于争议状态，②p38信号通路与细胞外的应激性刺激相关，其中一个因素为高渗，而H2S的干预是否也影响体液渗透压，这一点本课题并未考察，③H2S的药理作用是否还涉及其他作用靶点和通路还需进一步研究。