三氧化二砷联合白藜芦醇对肺癌细胞侵袭、迁移的影响及机制

郭天利 李宏健 庞 慧 焦同立 李春艳 于法明

(焦作市第二人民医院肿瘤内科，河南 焦作 454001)

三氧化二砷(As2O3)是一种剧毒，但在治疗疾病方面具有重要作用，如治疗急性早幼粒白血病具有较好的疗效〔1〕。近年来的研究显示，As2O3具有抑制肿瘤生长的能力，对多种肿瘤如肝癌〔2〕、肺癌〔3〕、胃癌〔4〕、结肠癌〔5〕等均发挥一定的抑制作用。但在临床应用中发现，As2O3浓度过高会对机体产生严重的毒副作用〔6〕。因此，为了减少As2O3的毒副作用及提高其作用效果，临床上常采取联合用药的方式。白藜芦醇是一种分布范围较广的天然多酚，能通过多种方式调节恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭，是一种高效预防肿瘤的药物。研究发现，As2O3联合白藜芦醇可增强其诱导细胞凋亡的能力，从而抑制肿瘤的发展〔7,8〕。但关于二者联合使用对肺癌细胞侵袭、迁移的相关作用及机制的研究较少。本研究旨在观察As2O3联合白藜芦醇对肺癌细胞侵袭、迁移能力的影响，并探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌细胞系A549购自中科院上海细胞库，As2O3购自北京双鹭药业有限公司，白藜芦醇、Matrigel胶购自美国Sigma公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清、胰酶(含EDTA)购自美国Hyelone公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Amresco公司，Transwell小室购自美国Corning公司，细胞裂解液及聚氨基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天公司，β肌动蛋白(actin)抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、MMP-9抗体购自武汉博士德公司，辣根过氧化物酶标记(HRP)的山羊抗兔二抗购自北京康为公司，波形蛋白(Vimentin)抗体、钙黏蛋白E(E-cadherin)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司。细胞培养箱购自上海生物仪器厂，酶标仪购自美国宝特公司，凝胶成像系统购自英国Syngene公司。

1.2细胞的培养与处理 肺癌A549细胞培养于DMEM培养基，培养基中包含10%胎牛血清及1%的青-链霉素，置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，每2 d更换一次培养基，每3 d传代一次。取生长状态良好的细胞加入不同浓度白藜芦醇联合10 μmol/L As2O3进行处理24 h，对照组加入无血清培养基。

1.3MTT法检测细胞增殖活性 以每孔1×104个细胞接种于96孔板上，待细胞贴壁后，加入不同浓度白藜芦醇(15、30、60、120 μmol/L)进行干预，37℃培养箱中培养48 h后，每孔加入100 μl MTT(5 mg/ml)，37℃避光培养4 h；弃去孔内液体，每孔加入100 μl DMSO，室温振荡5 min，酶标仪中检测570 nm波长下吸光值OD570 nm。计算细胞的存活率：细胞存活率(%)=实验组OD570 nm/对照组OD570 nm×100%。

1.4划痕实验 实验前48 h，将各组细胞浓度调整为5×105/ml，接种于6孔板中，加入60 μmol/L白藜芦醇联合10 μmol/L As2O3处理细胞，培养24 h后，待细胞的密度约为90%时，使用无血清的培养基饥饿培养24 h，采用20 μl无菌枪头在细胞层中快速划1～2道痕。吸出上清，无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞并更换为含胎牛血清的培养基，记录细胞0 h和24 h的距离，每组设5个重复，取平均值。

1.5细胞迁移、侵袭实验 将-20℃冰箱中的Matrigel胶放入4℃冰箱中过夜，与9倍体积的无血清培养基混匀。吸取50 μl Matrigel胶稀释液加入Transwell上室底部，37℃孵育3 h。收集各组细胞，使用含血清的培养基培养12 h，调整为1×104个细胞和200 μl加入Transwell上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的培养基，37℃培养24 h；1倍PBS清洗上室，湿棉签擦尽残留细胞，1%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色，37℃孵育5 min，显微镜下拍照、计数，取5个视野的平均值。迁移实验过程中，Transwell上室底部不加入Matrigel胶稀释液，其余步骤与侵袭相同。

1.6细胞中MMP-2、MMP-9及上皮间充质转化(EMT)蛋白的变化 收集对照组、60 μmol/L白藜芦醇和10 μmol/L As2O3处理的细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，离心，吸取上清，采用BCA法检测蛋白浓度。配置适宜的分离胶和浓缩胶，吸取50 μg蛋白样品，进行电泳、转膜；5%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗，4℃孵育过夜，加入相应二抗，37℃孵育2 h，加入ECL液显色，凝胶成像系统中拍照，Quantity One分析与内参β-actin的灰度值比值，表示目的蛋白的相对表达量。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件，多组计量数据间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较使用LSD-t检验。

2 结 果

2.1As2O3联合白藜芦醇对肺癌A549细胞增殖的影响 不同浓度的白藜芦醇作用于肺癌A549细胞，48 h后细胞的存活率〔15、30、60、120 μmol/L白藜芦醇组细胞存活率分别为(89.254±5.749)%，(72.369±3.687)%，(52.967±4.584)%，(38.214±2.457)%〕较对照组〔(100.003±0.008)%〕显著降低(P<0.05)；随着白藜芦醇药物浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低(P<0.05)。统计学分析显示，白藜芦醇的半数抑制浓度(IC50)为58.367 μmol/L。因此后续实验中，以60 μmol/L白藜芦醇作为实验浓度。

2.2As2O3联合白藜芦醇对肺癌A549细胞迁移的影响 与对照组相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜芦醇单独作用于A549细胞时，细胞的修复速度和迁移细胞数显著降低(P<0.05)，但二者间差异无统计学意义(P>0.05)；与As2O310 μmol/L组和白藜芦醇60 μmol/L组相比，As2O3+白藜芦醇组细胞的修复速度和迁移细胞数显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 As2O3联合白藜芦醇对肺癌A549细胞迁移的影响

与对照组相比：1)P<0.05；与As2O310 μmol/L相比：2)P<0.05；与白藜芦醇60 μmol/L相比：3)P<0.05；下表同

2.3As2O3联合白藜芦醇对肺癌A549细胞侵袭的影响 与对照组〔(115.32±16.478)个〕相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜芦醇单独作用于A549细胞时，细胞的侵袭细胞数〔(82.412±9.587)个，(79.368±8.789)个；P<0.05〕显著降低；二者单独使用时细胞的侵袭细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；与As2O310 μmol/L组和白藜芦醇60 μmol/L组相比，As2O3+白藜芦醇组细胞的侵袭细胞数显著降低〔35.269±5.784)个，P<0.05〕。

2.4As2O3联合白藜芦醇对肺癌A549细胞中MMP-2、MMP-9及EMT蛋白的影响 与对照组相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜芦醇单独作用于A549细胞时，细胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05)，下调Vimentin蛋白(P<0.05)，上调E-cadherin蛋白(P<0.05)；与As2O310 μmol/L组和白藜芦醇60 μmol/L组相比，As2O3+白藜芦醇组细胞中MMP-2、MMP-9蛋白显著降低(P<0.05)，抑制Vimentin蛋白表达(P<0.05)，促进E-cadherin蛋白水平(P<0.05)。As2O310 μmol/L组与白藜芦醇60 μmol/L组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表2。

图1 As2O3联合白藜芦醇对肺癌A549细胞中MMP-2、MMP-9及EMT蛋白的影响

组别MMP-2/β-actinMMP-9/β-actinVimentin/β-actinE-cadherin/β-actin对照组0.823±0.0890.653±0.0660.562±0.0570.649±0.068As2O3 10 μmol/L组0.689±0.0751)0.482±0.0451)0.420±0.0431)0.856±0.0821)白藜芦醇60 μmol/L组0.692±0.0711)0.463±0.0481)0.436±0.0481)0.834±0.0871)As2O3+白藜芦醇组0.423±0.0451)2)3)0.247±0.0261)2)3)0.215±0.0241)2)3)1.145±0.1691)2)3)

3 讨 论

肺癌组织易发生转移，对常规的化学治疗药物不敏感，是其死亡率较高的主要原因之一。白藜芦醇是一种天然的多酚类物质，具有很强的生物特性。研究已经证实，白藜芦醇对多种肿瘤如乳腺癌、子宫内膜癌等具有显著的预防作用〔9,10〕。As2O3也是近年来研究的相对较多的抗肿瘤药物。报道显示，As2O3可作用于Bcl-2家族，从而诱导胃癌细胞的凋亡〔11〕。在人肾母细胞瘤中，As2O3可抑制CyclinD1蛋白的表达量，诱导细胞的凋亡〔12〕。在食管癌中，As2O3能有效抑制细胞的侵袭及血管生成能力，可能与阻碍食管癌细胞间的黏附力及运动能力有关〔13〕。在探究抗肿瘤药物的联合使用效果时，常选用10 μmol/L As2O3作为研究对象〔14〕。在本实验中，不同浓度白藜芦醇(15、30、60、120 μmol/L)作用于肺癌细胞，随着浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低。

在肿瘤的转移过程中，细胞外基质黏附作用的改变发挥重要作用。在此过程中，肿瘤细胞会分泌和表达相关蛋白酶如组织蛋白酶、MMPs等，促进组织基质的降解及血管的生成，从而发挥促进肿瘤生长和转移的作用〔15,16〕，其中以MMP-2、MMP-9蛋白的作用最关键〔17〕。此外，EMT过程与肿瘤组织转移、细胞的分化等密切相关。EMT过程以E-cadherin上皮标志物表达降低、Vimentin等间质标志物表达增加为主要特征。研究发现，发生EMT的肿瘤细胞具有较强的侵袭、迁移能力〔18〕。在胃癌细胞中，As2O3和白藜芦醇均可通过调控MMP-2、MMP-9蛋白水平参与肿瘤细胞的侵袭、迁移过程〔19,20〕。白藜芦醇还可调控EMT蛋白表达，抑制EMT，降低食管癌细胞的侵袭、迁移〔21〕。本研究表明，As2O3和白藜芦醇联合抑制细胞的侵袭、凋亡与MMPs水平及EMT过程有关。

综上所述，As2O3和白藜芦醇联合使用可增加二者抑制肺癌细胞侵袭、迁移的能力，其可能的作用机制与二者联合处理进一步降低细胞中MMPs的水平、抑制细胞外基质的降解和EMT过程有关。