胃癌干细胞制备方法及在胃癌侵袭转移中的机制

邹兴斌

(长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

胃癌是临床上常见的恶性肿瘤，目前，临床上对于胃癌治疗方法相对较多，包括手术疗法、化疗、放疗等，分子靶向药物作为一种新型的治疗方法在胃癌治疗中也开始运用〔1〕。这些方法虽然能改善患者症状，但是5年生存率相对较低，主要与胃癌的转移、耐药及复发等有关。肿瘤干细胞(CSCs)是一类特殊的细胞，具有自我更新能力、高效DNA修复能力及多向分化潜能〔2，3〕。研究发现，在多数恶性肿瘤中存在CSCs，该细胞具备自我分化能力，并且在结肠癌、肝癌、乳腺癌及胰腺癌中有表达〔4，5〕。目前，对于GCSCs的制备方法存在较大的争议，常规分离鉴定方法以侧群细胞(SP)法和细胞表面标志物分选法为主，这些方法虽然能分离鉴定GCSCs，但是效果不佳，获得的细胞纯度相对较低，难以满足实验需要〔6，7〕。本研究旨在探讨胃癌干细胞的制备方法及其在胃癌侵袭转移中的机制。

1 对象和方法

1.1材料 人胃癌SGC7901细胞株：长春医学高等专科学校提供；GCSCs细胞：国家重点实验室提供。8只裸鼠，体重20～30 g，平均(27±3)g，实验过程中对裸鼠饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导意见》〔8〕相关规则。所有试验通过长春医学高等专科学校动物委员会批准同意，喂养动物房间通风良好，昼夜12 h采光，恒温、恒湿，定期紫外线消毒。

1.2主要仪器和试剂 见表1。

表1 主要仪器和试剂

1.3方法

1.3.1细胞分离及培养 ①细胞复苏：从液氮灌中取冻存管，置37℃中水浴，快速摇晃确保1～2 min内融化，将细胞冻存液放置在10 cm板培养皿中，加入8 ml培养液，混匀，每天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态。②传代培养：细胞贴壁融合80.0%以上开始传代培养，取5 ml培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，加入胰蛋白酶漫过细胞，混匀后吸出消化液，37℃温箱中保温4 min，待细胞间隙变大，形态近似圆形后停止消化。③细胞冻存：选择对数生长期细胞，利用负压吸引器吸取培养皿上的培养基，用PBS冲洗3次，加入胰蛋白酶消化，吹打细胞。将获得的悬浮生长细胞转移到15 ml离心管中800 r/min离心3 min，去除上层清夜，加入冻存培养液，吹打吸管让细胞均匀重悬。最后将1.0～1.5 ml细胞放入冻存管并置于-80℃冰箱中，次日放入液氮罐中保存。④胃癌细胞培养：取贴壁生长的人胃癌SGC7901细胞株，放入10.0%FBS的RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2，每2～3 d换液1次，待细胞培养融合90.0%时进行传代培养。⑤胃癌干细胞培养：胃癌干细胞为悬浮生长细胞，将细胞放置在超低黏附培养瓶中，37℃ 5%CO2培养箱中培养，放入无血清培养基，接种后每天添加适量培养基，7～10 d开始传代培养及扩增〔9，10〕。

1.3.2致瘤性和侵袭性 ①球形克隆实验：取1×103个人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞，将其接种在超低黏附6孔板中，加入无血清培养基，37℃ 5%CO2培养箱中进行培养，接种后每天观察瘤球形成情况。②平板克隆实验，取1×103个人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞，将其接种在超低黏附6孔板中，用含有10.0%FBS的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d换液1次，每天观察克隆形成情况。③裸鼠成瘤实验：消化胃癌细胞吹打制备单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，用PBS洗涤，以PBS重悬细胞，采用血球计数板计数后PBS稀释细胞到50 μl含所需细胞数，采用无菌注射器注射到裸鼠腋下，标准无菌条件下饲养，每3～5 d观察动物状态及成瘤情况〔11,12〕。

1.3.3转移能力测定 Transwell迁移试验测定人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞在胃癌转移中的作用。让血清饥饿12～24 h，制备人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞悬液，取24孔板，加入600 μl体积分数20.0%血清，将小室浸入孔中使其湿润，充分消化细胞，待消化停止后开始计数细胞。按2×105细胞浓度取200 μl放细胞溶液到小室中，将24孔板放入37℃ 5%CO2培养箱中培养，根据两种细胞迁移性能不同计算不同时间段透膜细胞数，将其放置在甲醛中固定15 min，放入1 ml结晶紫染色15 min，观察透膜情况〔13〕。

1.3.4基因芯片法测定ANTXR2水平 将ANTXR2的编码区载入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中，取对数生长的人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞，消化后制备续保悬液，计数后按照每孔5×104个细胞接种在24孔板中，过夜培养后将稀释好的干扰病毒和对照慢病毒分别放入细胞培养基中，培养24 h后换液一次，去除病毒，扩增后利用流式细胞仪分选感染细胞中的GFP阳性细胞，采用实时定量PCR方法检测2种细胞下ANTXR2水平表达情况，利用免疫荧光法检查ANTXR2及CD44共表达情况〔14〕。

2 结 果

2.1胃癌干细胞培养 人胃癌SGC7901细胞株培养后开始贴壁生长，培养条件为RPMI-1640(浓度为10.0%FBS)；GCSCs细胞为悬浮生长，培养条件为无血清培养基，细胞贴壁生长后呈梭形的间质形态。见图1。

A为贴壁生长的人胃癌SGC7901细胞株；B为悬浮生长的GCSCs细胞；C为贴壁生长的GCSCs细胞(箭头表示呈梭形的间质形态)图1 不同培养条件下生长的胃癌细胞(×100)

2.22种细胞致瘤性和侵袭性比较 ①球形克隆实验：将3×103个细胞接种在6孔板中，加入无血清培养基，连续培养20 d，随机取5个视野，计数每个视野瘤球个数。结果显示：GCSCs细胞瘤球数量为(63.92±4.51)个，显著多于人胃癌SGC7901细胞株的(6.49±0.70)个(P<0.05)，见图2。②平板克隆实验：将1×103个细胞接种在6孔板中，加入由RPMI-1640组成的3 ml培养基中培养10 d，随机取5个视野，计数每个视野瘤球个数。结果显示：GCSCs细胞瘤球数量为(9.61±1.59)个，显著多于人胃癌SGC7901细胞株的(1.78±0.82)个(P<0.05)。见图3。③裸鼠成瘤实验：成瘤能力是鉴定GCSCs细胞的金标准。结果显示：裸鼠体内移植1×104个细胞球即可发生肿瘤。GCSCs细胞移植瘤直径，显著大于人胃癌SGC7901细胞株(P<0.05)。见图4。

A为人胃癌SGC7901细胞株形克隆实验结果；B为GCSCs细胞球形克隆实验结果图2 人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞球形克隆实验(×100)

A为人胃癌SGC7901细胞株平板克隆实验结果；B为GCSCs细胞平板克隆实验结果图3 人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞平板克隆实验结果(×100)

A为GCSCs细胞成瘤情况(瘤体相对较大，瘤较多)；B为人胃癌SGC7901细胞株成瘤情况(瘤体单一，体积较小)图4 人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞成瘤实验结果

2.3人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞转移能力测定 Transwell迁移试验结果显示，GCSCs细胞穿过基底膜细胞数为(171.92±12.31)个，显著高于人胃癌SGC7901细胞株的(85.39±4.91)个(P<0.05)。结晶紫染色显示，GCSCs穿过基底膜细胞数，多于人胃癌SGC7901细胞株，提示GCSCs转移能力更强。见图5。

2.4基因芯片法测定ANTXR2水平 采用流式细胞术检测人胃癌SGC7901细胞株中ANTXR2阳性细胞比例占4.98%；GCSCs中ANTXR2阳性细胞比例占85.48%。通过对ANTXR2阳性的胃癌组织切片，实时定量PCR方法测定显示：ANTXR2与干细胞标志CD44有共定位现象，提示ANTXR2是GCSCs细胞中的相关分子。见图6。

A为人胃癌SGC7901细胞株转移能力结果；B为GCSCs细胞转移能力结果图5 人胃癌SGC7901细胞株和GCSCs细胞转移能力比较(×100)

图6 基因芯片法测定ANTXR2水平结果

3 讨 论

随着人口老龄化日益加剧及生活方式的改变，导致胃癌病发生率呈现上升及年轻化趋势。虽然人们对于胃癌的研究已获得一些新的进展，但是对胃癌的发病机制尚不完全知晓。CSCs最早于1个世纪前被提出，经过后人的努力及研究使得CSCs得到进一步充实和补充〔15〕。2006年，美国对CSCs进行了定义〔16〕：CSCs是一种特殊的细胞，具备自我分化能力及多向分化潜能，在多种恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。由于胃肠道上皮代谢相对较快，导致上皮细胞突变率较低，但是干细胞寿命相对较长并且容易产生积累，从而易诱发癌变。目前，胃癌干细胞的制备及分离方法相对较多，与其他成体干细胞类似，胃癌干细胞主要通过细胞表面标志物进行分离和鉴定〔17〕。国外学者研究〔18〕显示，在胃癌细胞中共存在三种腹膜转移高潜力的细胞，且均可以分离获得干细胞标志物。本研究中，通过成球培养法能成功分离/富集胃癌干细胞，同时，实验结果还显示，获得的胃癌干细胞具有肿瘤干细胞特性，能富集胃癌干细胞，提示成球培养法是获得胃癌干细胞的一种有效的方法〔19,20〕。

侵袭和转移是胃癌的重要生物学特征，也是影响疗效、术后复发和危及患者生命的独立危险因素〔21,22〕。本研究表明，GCSCs细胞转移能力更强。由于CSCs具备自我更新和高侵袭转移特性，研究中以CSCs为模型，筛选出可能调控CSCs自我更新及侵袭的分子ANTXR2。ANTXR2又称为毛细血管形态发生基因2，该基因位于染色体4q21.21上，能结合到炭疽毒素进入细胞中，属于炭疽毒素两个受体之一〔23〕。同时，ANTXR2具有与整合素相类似的性能，可以直接参与细胞外机制的调节。有报道显示，ANTXR2基因突变容易引起小儿玻璃样纤维瘤病。同时，ANTXR2能在正常及肿瘤血管内皮细胞中表达，并且在内皮细胞中表达能抑制细胞的增殖和小管形成能力〔24〕。本研究发现，人胃癌细胞ANTXR2表达后容易引起p-Src Tyr416磷酸化降低，从而引起p-Src Tyr527磷酸化位点增高。本研究结果提示胃癌干细胞在肿瘤侵袭、转移中机制复杂，ANTXR2在胃癌干细胞侵袭转移中发挥了重要作用，能进一步激活Src/ERK途径调控胃癌干细胞的侵袭转移，可以调控LRP6经过经典的Wnt信号通路发挥其生物学功能，从而促进肿瘤的发生、发展〔25,26〕。

综上所述，采用成球培养法能成功分离/富集胃癌干细胞，具有多向分化、克隆及成瘤能力，同时ANTXR2在胃癌干细胞侵袭转移中发挥了重要作用，可以作为胃癌预后指标。