IVF周期中含滑面内质网聚集体卵母细胞的形成及其对胚胎发育的影响

雷鑫，李弘，任文娟，惠董娜，刘建荣

(山西省人民医院生殖医学科，太原 030012)

卵母细胞质量极大的影响了人类辅助生殖技术的临床结局，尤其显著的表现在种植率和胚胎发育[1-4]。在临床过程中，卵母细胞评估主要是细胞内和胞浆外的形态特征，比如，第一极体的形态，卵周隙的大小及颗粒，透明带有无缺损，形态有无异常，折光体、致密细胞颗粒以及滑面内质网聚集体(smooth endoplasmic reticulum aggregates，SERa)的存在[5]。在人类辅助生殖中，经促排卵体外获得的卵母细胞中，有SERa形成者占有一定比例，这些卵母细胞最终发展为非整倍体的比例较高，影响随后胚胎发育和妊娠结局。本文回顾分析我中心行常规体外受精(IVF)后含SERa卵母细胞的形成及其对胚胎发育的影响。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2014年1月至2017年7月在山西省人民医院生殖医学科行常规IVF的313个周期(联合IVF/ICSI周期不包含在本次研究中)，根据受精拆除颗粒细胞后是否可见SERa，分为SERa+周期组和SERa-周期组，前者是指至少有一个SERa+卵母细胞，后者是指没有一个SERa+卵母细胞。比较两组之间患者年龄、不孕年限、GnRH总量及使用时间、注射HCG日E2、LH、P水平及获卵数、正常受精率、D3优胚率的差异。

二、方法

1.促排卵与取卵：按照文献[6]报道的标准临床方案进行促排与监测。卵巢刺激使用人绝经期促性腺激素(HMG，丽珠制药)联合卵泡刺激素(FSH，果纳芬，雪兰诺，瑞士)。促性腺激素的剂量依照患者的年龄，第3天血清FSH值和窦卵泡数量来个体化决定。当有3个或者更多优势卵泡达到17～18 mm时，使用5 000～10 000 U的人绒毛膜促性腺激素(HCG，丽珠制药)进行扳机。取卵在HCG注射之后34～36 h后进行。

2.受精、胚胎培养及形态观察：在取卵后3～6 h内完成受精。受精后16～20 h拆除颗粒细胞，在200×倒置显微镜下观察原核情况及细胞形态。受精后体外培养72 h，全程培养液采用Quinn’s Advantage(SAGE，美国)。

3.SERa的判断：卵母细胞受精后拆除周围包绕的颗粒细胞，发现有一部分异常卵母细胞的存在，在高倍镜下(200×)观察可见胞质中出现一些圆形、扁平且清晰的盘状物，该物质为滑面内质网聚集体(SERa)(图1)。

图1 胞质中出现SERa(→)的卵母细胞 (200×)

4.胚胎质量的评估：评估卵裂期胚胎形态，需要参照以下内容：卵裂球的数目，均匀程度，碎片的多少，是否有多核的存在，透明带和细胞质是否有残缺。卵裂期优质胚胎评价标准：D3胚胎 8～10细胞，碎片<15%，卵裂球均匀，没有多核，细胞质颗粒均匀，无内容物，卵周隙无颗粒，透明带无缺损。缺乏以上任何一项均不可判定为优质胚胎。

三、统计学分析

结 果

一、SERa出现情况

在常规IVF 313个周期中，SERa+的周期28例(8.9%)。

二、SERa+患者的一般情况

在本中心28例SERa+中，女方年龄(29.6±1.0)岁，不孕年限(3.4±0.4)年。Gn总量(2 250.00±170.52)U，Gn使用时间(8.8±0.3)d。注射HCG日女方激素水平：E2(8 926.02±1 486.56)pmol/L，LH(2.25±0.53)U/L，P(1.76±0.47)nmol/L。

三、SERa+周期组与SERa-周期组患者一般及促排卵情况比较

比较两组注射HCG日E2水平，Z=-2.241，SERa+周期组患者注射HCG日E2水平高于SERa-周期组患者E2水平，差异有统计学意义(P<0.05)。而两组患者年龄、不孕年限、Gn天数、Gn总量、注射HCG日LH水平及P水平差异均无统计学意义(表1)。

表1 SERa+周期组与SERa-周期组患者一般及促排卵情况比较(-±s)

注：与SERa-周期组比较，*P<0.05

两组获卵数比较，Z=-3.576，SERa+周期组患者获卵数高于SERa-周期组患者获卵数，差异有统计学意义(P<0.05)。比较两组2PN率(Z=-5.793)和D3优胚率(Z=-2.854)，SERa+周期组患者2PN率和D3优胚率低于SERa-周期组患者，差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 SERa+周期组与SERa-周期组实验室情况的比较[(-±s)，n(%)]

注：与SERa-周期组比较，*P<0.05

讨 论

在临床实践中，卵母细胞胞浆内和胞浆外的特征通常会对其质量产生影响，进而很大程度上影响人类辅助生殖技术的成功率。据报道，滑面内质网聚集体(SERa)就与胚胎发育及临床疗效有关[6]。

滑面内质网是真核细胞胞质内广泛分布的由膜构成的扁囊、小管或小泡连接形成的连续的三维网状膜系统[7]。与空泡不同，SER没有填充液体，也没有胞膜跟卵母细胞细胞质分开[8]。其主要作用是储存和释放Ca2+，引起受精时皮质颗粒的胞吐作用，对卵母细胞的成熟和受精以及早期胚胎的发育起到非常关键的作用[9]。

Munaswamy等[10]的分析发现，ICSI中SERa发生率为13%。本研究分析显示，在IVF周期，我中心的SERa+周期占比为8.9%。可能与我中心实行长时受精有关，有些SERa在双原核出现前已经消失，但它与第二极体释放的先后顺序目前尚不清楚。在本研究中发现，卵母细胞拆除颗粒细胞后SERa持续存在则意味着受精失败，与早前time-lapse live embryo imaging观察到的结果是一致的[5]。SERa的形成机制目前尚不明确。有一种假设，卵母细胞缺陷的显现最终是由不恰当的卵巢刺激造成的。本研究发现卵胞质中 SERa的出现与患者年龄、不孕年限、Gn总量及使用时间、注射 HCG 日血LH、P水平无关，而与注射 HCG 日血 E2水平有很大的相关性，所有SERa+周期组 患者都有较高 E2水平，这可能提示高 E2水平是引起 SERa 形成的重要原因。并且本研究发现，与SERa-周期组相比，SERa+周期组在获卵数上显著增加，说明卵巢刺激不当可能是SERa出现的原因。

SERa，作为一种细胞质的畸形，有研究提出，在ICSI周期中，卵胞浆中出现SERa可显著降低受精率、有效胚胎形成率进而影响卵母细胞利用率[11]。而且，移植来自SERa+卵母细胞的胚胎可见畸形新生儿[12]。Beckwith-Wiedemann综合征是其致病的一种畸形[13]。电镜下可见SERa具有更多微小致病的结构[13]。因此，认为卵母细胞SERa的形成会导致各种异常出现的风险增加，因此应该废弃SERa+卵母细胞，并且要仔细检查同一周期的卵母细胞[14]。然而，最近也有多项报道，含SERa的卵母细胞可以正常受精并获得健康后代[15-16]。有一项针对13个相关研究的系统分析显示，在SERa+周期中183个婴儿已经出生，其中171个是正常的，8个存在畸形，3个是死胎，1个夭折[17]。目前缺少对SERa卵母细胞评估的研究，其对子代的影响尚存争议；具体对IVF周期中出现SERa的意义的研究尤为少见。本研究将本中心的28例SERa+的IVF周期与SERa-周期的数据进行对比，发现两组中2PN率、D3优胚率存在显著差异，分析可能是因为SERa形成影响了卵母细胞正常钙储存与钙释放，进而影响了受精和胚胎发育[18]。Otsuki等[19]研究发现，SERa在消失之前直径是不断增长的，该现象可能解释了受精率下降的原因是由于体积较大的SERa限制了原核的形成。然而有些研究发现，在ICSI周期两组的D3优胚率却是相似的[20]。至于为什么受精方式的不同导致优胚率存在差异，目前并不是很清楚。研究[7]中发现，一些SERa+MII卵母细胞是可以避免异常钙释放，进而发育成囊胚。提示SERa的尺寸、形态及出现的频率等可能都是影响其胚胎发育和临床结局的重要因素。Otsuki等[19]发现，直径越小的SERa(比如2～5 μm)，没有电镜是不能观察到的。提示我们可能会有一部分SERa阳性的病例会被忽略，而且与接近卵母细胞中央体积较大的SERa相比，这些只位于卵胞浆皮层区域小的SERa是否具有同样的危害目前并不清楚。

目前，SERa+卵母细胞是否应该废弃仍旧存在争议。对于那些临床助孕治疗中获得SERa+胚胎并且胚胎数目不足的患者，是否移植SERa+胚胎需要做更多的研究。SERa可能与基因印迹障碍疾病有关，提示来自同一周期的SERa+与SERa-卵母细胞是否应该都废弃。因此，考虑目前这些具有争议性的数据以及可能存在的遗传学问题，是否移植被SERa影响的胚胎仍需要长期的关注。