高效液相色谱法检测鸡肉中的泰乐菌素

罗玉莹，王 艳*，李艳萍

（银川大学石油化工学院，宁夏银川 750105）

泰乐菌素（tylosin）是从弗氏链霉菌的培养液中获得的一种抗生素，称为大环内酯类抗生素[1]。作为饲料添加剂，长期过量使用或使用不当的给禽畜使用抗生素，就会间接对人类的健康构成严重的危害，严重者可造成过敏性休克，甚至会危及到生命。2006年欧盟成员国就全面禁止使用抗生素作为促生长剂[2]。目前，大环内酯类兽药的检测方法主要有：微生物法[3，4]、气质联用法（GC/MS）[5]、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLCMS/MS）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7]。泰乐菌素对分离样品的要求极高，而高效液相色谱法不仅能实现很好地分离，准确进行定性和定量分析，还大大降低了分析成本[8]。在牛奶、废水等介质中泰乐菌素检测都有研究，但有关鸡肉中泰乐菌素的检测，目前鲜见报道，所以本文利用高效液相色谱法，作为研究鸡肉中的泰乐菌素的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 供试样品与标样 泰乐菌素标准品：购自山东西亚化学工业有限公司，纯度95%。

本实验研究所用鸡肉采集于超市。

1.1.2 仪器与试剂 高效液相色谱仪（LC-20AT日本岛津公司）；超声波清洗仪（KQ-100昆山市超声仪器有限公司）；台式离心机（TDL80-2B上海安亭科技仪器厂制造）；电子天平（FA1104N上海精密科学仪器有限公司）；紫外-可见分光光度计（UV-1800苏州市莱顿科学仪器有限公司）；旋转蒸干仪（RE-3000A上海越众仪器设备有限公司）。

甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；正己烷（分析纯）；乙酸乙酯（分析纯）；磷酸二氢钾（分析纯）。

1.2 实验部分

1.2.1 色谱条件 色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；检测波长：283.5 nm；流速：1 mL/min；流动相是甲醇：（0.04 mol/mL，pH=2.5），磷酸二氢钾（v：v）=55：45；进样量 20 μL。

1.2.2 标准储备液和混合标准工作液的配制 准确称取10 mg泰乐菌素标准品于干净的100 mL的容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成浓度100 μg/mL的标准储备液，4℃避光保存。根据需要用甲醇逐级稀释配成适当浓度的标准工作液，现配现用。

图1 流动相选择色谱图

1.2.3 样品处理 将超市采集的健康鸡肉绞成肉泥，置于冰箱保存。使用时自然解冻，称取5.0 g样品置于50 mL具塞离心管中，加入20 mL甲醇于离心管，超声10 min，以3 000 r/min离心10 min，收集上清液。向沉淀物再加入20 mL提取剂，重复前面的操作2～3次，合并上清液。向上清液中加入30 mL正己烷脱脂，振荡5 min，静置分层，弃去上层正己烷。在40℃减压旋转蒸干，加入甲醇定容至5 mL，0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.2.4 标准曲线的绘制 取标准工作液，用甲醇稀释成质量浓度分别为 2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、12 μg/mL 和16 μg/mL溶液。按照1.2.3项色谱条件进行测定，以峰面积与质量浓度做线性回归。

1.2.5 方法的加标回收率 本实验样品在2.0 μg/mL，3.0 μg/mL，4.0 μg/mL3 个添加水平下，按 1.2.3 项所描述进行样品处理后HPLC测定，计算回收率。

1.2.6 方法的精密度 对鸡肉样品提取液重复进样6次，每次20 μL，记录每次检测的峰面积，计算相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 流动相的优化

2.1.1 流动相的选择 研究相同体积比的乙腈：超纯水、甲醇：超纯水、乙腈：磷酸二氢钾（0.04 mol/mL，pH=2.5）、甲醇：磷酸二氢钾（0.04 mol/mL，pH=2.5）4 种流动相的色谱分离效果。结果表明：甲醇：磷酸二氢钾（0.04 mol/mL，pH=2.5）作为流动相峰型对称、且峰值高。因此采用甲醇：磷酸二氢钾（0.04 mol/mL，pH=2.5）作为流动相（见图1）。

2.1.2 流动相的配比 流动相的配比优化中，选择了体积比为 70：30；60：40；55：45；50：50 的甲醇：磷酸二氢钾（0.04 mol/mL，pH=2.5）作为流动相，在选择体积比为55：45有较好峰型（见图2）。

图2 流动相不同体积下较优色谱图

2.2 样品前处理的优化

2.2.1 样品提取剂的优化 本实验分别对比考察了甲醇，乙腈，乙酸乙酯3种溶剂对鸡肉样品中泰乐菌素的提取效果，结果表明，甲醇提取时可以得到满意的回收率，所含杂质也较少（见图3）。

图3 不同提取剂对泰乐菌素的影响

2.2.2 提取剂体积的优化 通过分别比较甲醇体积为10 mL，15 mL，20 mL，25 mL 时的分离效果，研究表明，甲醇体积为20 mL时提取效果较好（见图4）。

图4 不同体积的提取剂对泰乐菌素的影响

2.3 线性关系

研究表明：线性范围为 2 μg/mL～16 μg/mL 时，以峰面积为纵坐标，以泰乐菌素的质量浓度为横坐标，溶液浓度与峰面积呈现良好的线性关系，线性方程为y=6 366.3x-629.49，相关系数为 R2=0.999 7（见图 5）。

图5 泰乐菌素标准溶液线性方程和相关系数

2.4 加标回收率及精密度

在空白的鸡肉样品中进行加标回收实验，回收率在96.33%～101.73%的范围。在6次进样所得峰面积相对标准偏差（RSD）小于5%（见表1）。

表1 加标回收率和相对标准偏差

2.5 鸡肉样品的测定

本实验最终检测鸡肉样品中泰乐菌素含量为0.029 6 mg/kg，低于我国动物性食品中兽药最高残留量标准（0.1 mg/kg）。

3 总结

高效液相色谱法检测鸡肉中泰乐菌素残留量的研究，结果表明，此方法灵敏度较好，对待测样品的处理要求简单，实验的精密度、回收率为较高。本实验所测泰乐菌素含量为0.029 6 mg/kg，低于最高残留量符合残留检测分析要求。此方法为检测鸡肉中泰乐菌素含量时，提供了有效的定量分析。