响应面试验优化绿豆粉山羊奶干酪的制备工艺及其结构分析

常兰兰，仲玉备，王少博，陈树兴

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳,471023)

在欧美国家，山羊奶被视为奶中精品，国际学界誉其为“奶中之王”[1]。我国山羊奶资源丰富，并且具有较多优点，例如脂肪球直径小，能够增强铁、钙的吸收，特别适合老年人、高血压人群、婴幼儿饮用。以山羊奶为原料制得的干酪，脂肪含量适中，组织结构细腻，脂肪球、酪蛋白颗粒较小，感官评分较高[2]。绿豆是我国药食兼用的食材，人体必须氨基酸含量达6.9%，蛋白质含量高达24.7%，其清热解毒、增进食欲、抗过敏[3]、泻火等功效为大家所知[4]。

有报道称，陈雪等[5]研究5种发酵剂在干酪成熟过程中对其质构、感官、风味物质形成及蛋白水解程度等方面的影响，确定了干酪发酵剂菌株；贾鲁彦等[6]通过向牛奶添加绿豆，成功制作出具有口感细腻、风味清香淡雅具有清热解毒功效的酸奶；祝敏等[7]研究了大豆分离蛋白对干酪风味物质的影响，最终确定大豆分离蛋白的添加比例及期望风味物质的产生；常有报道称绿豆被用来加入到山羊奶中制成绿豆酸奶[8]，目前，对于将绿豆粉加入山羊奶中制作切达干酪缺乏系统的研究。

本研究通过向山羊奶中添加一定质量的绿豆粉，采用四元二次通用旋转组合设计优化出最佳生产工艺，最终制作出口感细腻，且具有山羊奶、绿豆粉特有风味的干酪。选用添加绿豆粉部分代替山羊奶，在制备绿豆粉山羊奶干酪的过程中，乳成分的改变可能会引起酪蛋白胶束的胶体状态，为了分析添加绿豆粉对制得的干酪热力学变化的影响，在其成熟期间对其差示量热扫描(DSC)。绿豆粉为豆科植物绿豆的种子加工而成，每100 g绿豆粉中含蛋白质22.1 g，由于其中某些酶的作用可能会引起山羊奶干酪中蛋白质二级结构的变化，运用傅里叶红外(FTIR)对山羊奶干酪中蛋白结构进行了研究，为山羊奶干酪系列产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山羊奶购于河南省洛阳市吉利区绿色牧场，选取的山羊奶是略带微黄色的均匀胶体，无黏稠、浓厚及分层等异常现象出现；不得有肉眼可见的机械杂质；具备山羊奶的正常气味，不得有苦、咸、涩、臭等异味[9]的正常生鲜山羊奶，放置-4 ℃冰箱冷藏备用。

绿豆购于河南洛阳市洛龙区学子街丹尼斯超市，选取颗粒饱满、均一、表面光滑，没有皱缩，无霉变的东北绿豆，用自来水清洗3次，沥干，微波加热直至绿豆颗粒熟透，置于高速粉碎机进行粉碎，并过200目筛后备用。发酵剂为干酪专用发酵剂，凝乳酶为小牛皱胃酶。无水醋酸钠，CaCl2，CuSO4，K2SO4，H2SO4等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UL80BC实验型干酪机，杭州优创科技有限公司；全自动凯氏定氮仪，上海迅博科学仪器公司；高速分散均质机，上海标本模型厂；KQ2200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；PHS-3型pH计，上海亿峰科学仪器有限公司;差示量热扫描仪，苏州雅程设备公司；中红外光谱仪，天津港东科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 绿豆粉山羊奶切达干酪加工工艺流程

新鲜山羊奶→过滤→添加绿豆粉→巴氏杀菌→自然冷却31 ℃[10]→添加发酵剂→搅拌5 min→添加CaCl2→凝乳50 min→调整pH值到6.12→添加凝乳酶→凝乳30 min→切割→搅拌→静置25 min→升温到41 ℃→排乳清→加食盐(2%)→压榨成型→成熟。

1.3.2 绿豆粉山羊奶干酪水分含量的测定

将干酪切成2 cm×2 cm×2 cm的正方体，放置于100 ℃鼓风干燥箱中，干燥1 h，取出，置干燥器中，室温放置20 min，精密称定，直至2次称量结果相差0.1 mg以下达到恒重[11]。

1.3.3 绿豆粉山羊奶干酪出品率的测定

(1)

式中：W1，绿豆粉山羊奶干酪的质量，g；W0，原料山羊奶的质量，g。

(考虑到每个试验组干酪含水量的差异，将实测出品率校正到水分含量为45%的出品率[12])

校正出品率/%=

(2)

1.3.4 单因素试验设计

分别以发酵剂的添加量(质量分数0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、CaCl2的添加量(质量分数0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)、凝乳酶的添加量(质量分数0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)、绿豆粉的添加量(质量分数0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%)4个因素，每个因素设置5个水平，每个水平重复3次，以绿豆粉山羊奶干酪的出品率为指标进行单因素试验。

1.3.5 四元二次通用旋转组合设计优化绿豆粉山羊奶干酪的制备工艺X1、X2、X3、X4

在单因素的试验的基础上，对发酵剂添加量(X1)、CaCl2添加量(X2)、凝乳酶的添加量(X3)、绿豆粉的添加量(X4)4个因素进行四元二次通用旋转组合设计，因素水平见表1。

表1 四元二次通用旋转组合设计试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in second-order rotation combination experimental design

1.3.6 差示量热扫描(DSC)的测定

干酪放置于坩埚内，对其进行压样密封，DSC测定条件设定为[14-16]：30 ℃保持10 min，以3 ℃/min升温至120 ℃，用N2作为保护气。

1.3.7 傅里叶红外光谱测定

将干酪与KBr以1∶100的质量比，放入玛瑙研钵中进行充分的研磨后，压力确定为12 MPa，时间为1 min，压出规则样片，用傅里叶红外光谱仪进行测定，其中光谱选择范围为：500～4 000 cm-1[17]。

1.3.8 数据处理

统计分析采用DPS 7.5软件分析，图采用Origin 8.5软件绘制，利用Design Expert 8.05b进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

发酵剂的添加量、CaCl2添加量、凝乳酶添加量、绿豆粉添加量对出品率的影响如图1～图4所示。

图1 发酵剂的添加量对出品率的影响Fig.1 The effect of the amount of starter on the yield

由图1可知，发酵剂的添加量在0.8%～1.2%(质量分数)，干酪出品率随着发酵剂添加量的增加逐渐增大，呈现直线上升，在此范围内产品具有合适的酸度，口感温和、香醇，且感官评分较高，发酵剂添加量确定为0.8%～1.2%(质量分数)。

由图2可知，随着CaCl2添加量的增加，出品率逐渐增加，CaCl2的添加量在0.03%～0.05%(质量分数)时，干酪绿豆味与奶香味组合恰当，CaCl2的添加对干酪的凝乳具有较大的影响，CaCl2添加量较小时，干酪的凝乳效果较差，使得出品率很低，因此CaCl2添加量确定为0.03%～0.05%(质量分数)。

图2 CaCl2的添加量对出品率的影响Fig.2 The effect of CaCl2 addition on the yield

由图3可知，随着凝乳酶添加量的增加，出品率呈现先增大后减小的趋势，当凝乳酶的添加量在0.03%～0.05%(质量分数)出品率较优，在此范围内，干酪凝乳时间缩短，乳清析出较快，致使干酪质地细腻，组织状态均一，出品率较高，因此凝乳酶添加量确定为0.03%～0.05%(质量分数)。

图3 凝乳酶的添加量对出品率的影响Fig.3 The effect of the amount of rennet on the yield

由图4可知当绿豆粉的添加量在0.6%～1.2%(质量分数)时制备出的干酪含水率较低，出品率呈现较高水平，且干酪山羊奶香味较浓，无明显绿豆腥味，因此确定绿豆粉添加量为0.6%～1.2%(质量分数)。

图4 绿豆粉的添加量对出品率的影响Fig.4 The effect of the addition of mung bean powder on the yield

2.2 制备绿豆粉山羊奶干酪的四元二次通用旋转组合设计试验结果

采用DPS 7.5数据处理软件设计了4因素5水平全实施的一共31组试验点的通用旋转组合试验，以绿豆粉山羊奶干酪出品率(Y)为指标，试验方案及结果如表2所示。

表2 四元二次通用旋转组合设计试验结果Table 2 Factors and levels used in second-order rotation combination experimental design with experimental results

经回归拟合后，得到绿豆粉山羊奶干酪的出品率(Y)对发酵剂添加量(X1)、CaCl2的添加量(X2)、凝乳酶的添加量(X3)、绿豆粉的添加量(X4)的二次多项式回归方程为：

2.2.1 建立模型与显著性检验

对二次回归方程进行F检验及失拟检验，结果表明：F2=9.23，p=0.000 1<0.01，极其显著，R2=0.89；失拟检验F1=2.09，p=0.091>0.05，不显著，表明回归方程和实际情况拟合较好。因此该模型是合适的，可用于研究制备绿豆粉山羊奶干酪出品率的分析。

表3 试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model equation

注：当p<0.01时，差异极显著；p<0.05，差异显著。

2.2.2 响应面交互作用分析

从交互作用及研究意义考虑，选择发酵剂的添加量(X1)及绿豆粉的添加量(X4)进行响应面分析，将另外2个因素固定在0水平上[18]，采用Design Expert 8.05b 软件进行统计分析，观察发酵剂的添加量、绿豆粉的添加量2个因素的交互作用。绘制响应面以及等高线图，并进行试验因素对制备绿豆粉山羊奶干酪出品率影响的两两交互作用的进行评价，同时确定各个因素的最优选择范围。由图5可知，响应面坡度陡峭，说明发酵剂的添加量(X1)、绿豆粉的添加量(X4)对制备绿豆粉山羊奶切达干酪出品率的影响均较大。由响应面的等高线图可知，发酵剂的添加量1.00%～1.10%(质量分数)、绿豆粉的添加量0.9%～1.05%(质量分数)时干酪出品率较高。同表3的显著性分析结果一致，响应面的等高线图呈现出椭圆形，表明两者交互作用极显著。发酵剂的添加量(X1)和绿豆粉的添加量(X4)交互作用显著可能是因为发酵剂影响干酪的凝乳时间，绿豆粉的添加影响着干酪的含水率，最终导致发酵剂的添加量和绿豆粉的添加量对绿豆粉山羊奶干酪的出品率产生交互影响。

图5 发酵剂的添加量和绿豆粉添加量对制备绿豆粉山羊奶干酪出品率影响的响应面Fig.5 Response surface plots for the effects of mung bean powder addition and starter addition addition on the yield of mung bean powder goat cheese

2.2.3 验证试验

运用2个指标的试验结果采用加权综合评分法及多元回归分析，设定2个指标的加权值wj均为0.5，消除两个指标的量纲，计算加权综合评分值，以加权综合评分值为指标再按照单指标进行极差分析，得到制备绿豆粉山羊奶干酪的最优工艺参数组合为：发酵剂添加量1.002 2%(质量分数)、CaCl2的添加量0.035 2%(质量分数)、凝乳酶的添加量0.044 5%(质量分数)、绿豆粉的添加量0.897 9%(质量分数)。根据实际操作的可行性分析，将最佳制备条件修正为发酵剂添加量1.000%(质量分数)、CaCl2的添加量0.035%(质量分数)、凝乳酶的添加量0.045%(质量分数)、绿豆粉的添加量0.900%(质量分数)。修正后的最佳条件运用响应面模型计算，得到指标的值为：出品率10.30%。根据修正后的最佳工艺条件，进行5次重复试验，每个试验做3个平行，测得干酪出品率的均值为(9.64±0.21)%，与理论预测值的误差绝对值低于3%，经t检验结果为差异不显著(p>0.1)，说明运用四元二次通用旋转组合设计优化后得到的数学模型参数准确可靠。

2.3 绿豆粉山羊奶干酪的DSC测定分析

绿豆粉山羊奶干酪和纯羊奶干酪进行DSC的测定分析，热焓曲线的变化如图6所示，由图6可知，纯羊奶干酪的变性温度为78.3 ℃，绿豆粉山羊奶干酪的变性温度为82.4 ℃，加有绿豆粉干酪的的热焓值变化较显著，绿豆粉山羊奶干酪的吸收峰发生了迁移，变性温度升高了4.1 ℃，这可能是由于绿豆粉所含的某些酶而引起蛋白质的变性。

图6 绿豆粉山羊奶干酪和纯山羊奶干酪的DSC变化曲线Fig.6 DSC curve of improved mung bean powder goat cheese and pure goat cheddar cheese

2.4 傅里叶红外光谱分析(FTIR)

如图7所示，绿豆粉山羊奶干酪与纯山羊奶干酪进行的FTIR测定结果存在着一定的差异，说明绿豆粉中某些酶的作用而使得绿豆粉山羊奶干酪中蛋白质的微观结构发生了变化，蛋白质在中红外光区(500～4 000 cm-1)有若干的特征吸收峰。在酰胺I带中绿豆粉山羊奶干酪的吸收峰比纯山羊奶干酪的吸收峰较强，说明绿豆粉山羊奶干酪的二级结构中β-折叠、β-转角及α-螺旋结构的含量要高于纯山羊奶干酪，且在1 655 cm-1出现一个振动吸收峰。在酰胺Ⅲ带(1 220～1 330 cm-1)中，纯山羊奶干酪在1 229 cm-1处，出现了一个较强的吸收峰，此处为蛋白质α-螺旋的特征吸收峰，此吸收峰是由于α-螺旋中N—H键的弯曲振动的结果，而绿豆粉山羊奶干酪在此处的吸收峰则较弱，说明蛋白质的α-螺旋结构被破坏，添加绿豆粉有助于干酪中蛋白质结构的稳定。

图7 绿豆粉山羊奶干酪和纯羊奶干酪的傅里叶红外光谱Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy of goat cheese and pure goat cheese

3 结论

以干酪出品率为指标，通过四元二次通用旋转组合设计试验得出较好的回归数学模型，模型相关系数R2为0.89，表明模型较好，在试验范围内能较准确预测干酪出品率；4个因素对干酪出品率影响顺序为CaCl2的添加量>凝乳酶的添加量>发酵剂的添加量>绿豆粉的添加量。运用加权评分法最终确定制备绿豆粉山羊奶干酪的最佳方案为：发酵剂添加量1.00%(质量分数)、CaCl2的添加量0.035%(质量分数)、凝乳酶的添加量0.045%(质量分数)、绿豆粉的添加量0.90%(质量分数)。经过试验验证干酪出品率可达9.64%。绿豆粉山羊奶干酪与纯山羊奶干酪DSC及中红外图谱分析表明，向羊奶中添加绿豆粉制成的切达干酪出品率较高、热稳定性好等优点。

对绿豆粉山羊奶干酪的研究为制备特定风味需求的干酪系列产品的开发提供了指导。试验中所用的绿豆是东北绿豆，可能会由于其产地的局限影响到试验结果，还需选用不同产地的绿豆进行羊奶干酪制备的研究。