白酒中挥发性苦涩味物质的提取和分离

王尹叶，范文来，徐岩

(江南大学 生物工程学院,酿造微生物与应用酶学研究室，教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡，214122)

苦味和涩味是白酒中常见的异味[1]，直接影响着白酒的品质。我国各香型白酒都不同程度地存在苦、涩味问题。早期有学者推测白酒中呈苦味化合物可能是正丙醇、1-丁醇、异丁醇、异戊醇、糠醛、丙烯醛、单宁、硫化物、氨基酸等；呈涩味的化合物主要是乳酸、乳酸乙酯、异丁醇、异戊醇、糠醛和单宁等[2-3]。应用现代味觉研究技术即味觉稀释分析(taste dilution analysis，TDA)[4]研究发现，乳酸、2-糠酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2,3-二羟基丙酸、富马酸、马来酸、3-苯基乳酸、柠檬酸和琥珀酸在白酒中呈涩味[5]。然而，到目前为止，鲜见白酒中挥发性呈味物质的研究报道。

TDA技术是国际上研究食品味觉的常用方法[4]，即用感官评价与仪器分析结合的方法在食品中分离和鉴定不挥发的味觉活性物质。如运用TDA研究发现羟基苯甲酸乙酯和羟基肉桂酸乙酯是葡萄酒的重要苦味化合物；羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、黄酮-3-醇糖苷和二氢黄酮-3-醇鼠李糖苷被确定为葡萄酒的关键涩味化合物[6]。TDA技术还用于糖/氨基酸混合物发生美拉德反应的产物[4]、咖啡[7]、燕麦[8]、胡萝卜[9]、啤酒[10]、榛子[11]和奶酪[12]中呈苦味化合物研究；黑茶[13]、红醋栗[14]、菠菜[15]中呈涩味物质研究。但是，目前尚未有对挥发性呈味物质的研究报道。

本研究运用TDA的思路，拟建立一种白酒中挥发性苦味和涩味化合物提取、分离和鉴定的方法，以期确定白酒中呈苦味和涩味的挥发性物质，为消减白酒苦涩味，提升白酒品质提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒样品：芝麻香型原酒(64%vol)。

标准品与试剂： 乙醇、正丙醇、1-丁醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、糠醛、乳酸乙酯、乳酸、蔗糖、盐酸奎宁、NaCl、谷氨酸钠、单宁酸、磷酸和戊烷均为色谱级，购自美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醚为分析纯，购自国药集团，使用前进行重蒸。进行感官分析所用水为娃哈哈纯净水(购自杭州娃哈哈集团有限公司)，使用前用1 mol/L磷酸(GRAS列为食品和药物中的添加剂[16])将pH值调节至3.8。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪R-300，瑞士Buchi公司；便携式密度计DM 35，奥地利Anton Paar 公司；GC-6890N-MSD 5975，美国Agilent 公司；Waters半制备液相色谱(配有Waters 2627自动进样器、Waters 2489紫外/可见光检测器、Waters 2535 四元泵洗脱系统)，美国Waters 公司； N-EVAP111 氮吹仪，美国Organomation 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 味觉品评训练

味觉品评小组由从事白酒风味研究的10名学生和1 名具有12 年以上感官分析经验的教师组成，所有成员均没有味觉障碍史，且定期参加味觉培训(至少每周1次，持续2年)[4]。为尽可能减少任何有毒化合物的摄入，采用吞-吐法[13]进行感官分析，即试验材料1 mL放入口腔中，在口腔中保持10 s后吐出。

1.3.2 真空旋转蒸发

50 mL样品在30 ℃水浴条件下进行真空(10 kPa)旋转蒸发，得到挥发性组分和不挥发组分，挥发性组分直接用于品尝，不挥发组分经真空冷冻干燥[6]，并用纯净水复溶。采用0～5六点刻度法对2个组进行味觉品评。为防止嗅觉的干扰，味觉品评需要戴鼻夹。

1.3.3 梯度减压蒸馏提取白酒中呈苦味和涩味的化合物

取100 mL酒样置于250 mL旋转蒸发瓶中，进行梯度减压蒸馏(0.08、0.06、0.04、0.02 MPa)，设置不同水浴加热温度(40、50、60、70、80、85、90 ℃)，探索在最小真空度(0.08 MPa)能蒸馏出液体的最小加热温度，并在此温度下进行减压蒸馏，收集接收相。每1个梯度真空度条件蒸馏至5 min内没有液体滴下记为蒸馏结束，记录每1个梯度真空条件下蒸馏时间和馏出组分体积。共收集到4个馏出组分，标记为组分A、B、C和D，对馏出组分进行感官品评。

1.3.4 半制备分离

对梯度减压蒸馏提取到的呈苦味和涩味的组分B进行半制备分离。分离条件：进样量800 μL；流动相A：乙醇，流动相B：水；采用X Bridge®Pre C18色谱柱(10 mm×250 mm，1.8 μm，Waters公司)，流速3 mL/min，检测波长277 nm。洗脱条件：乙醇和水初始体积比5∶95，乙醇在8 min内上升至20%，20 min上升至50%，12 min升至100%，并维持25 min。按色谱峰收集到10 个亚组分，并标记为B-1～B-10，制备分离运行10 个回合，合并收集的相应组分，对所有组分进行溶剂萃取。

1.3.5 溶剂萃取

用密度计(DM 35)分别测量半制备组分B-1～B-10的酒精体积分数，并用纯净水稀释至10%，每1个组分分别使用戊烷和乙醚进行萃取，每个溶剂萃取3次(萃取剂的使用体积是稀释后组分总体积的50%)。收集到的有机相平均分成2份，1份氮吹浓缩至250 μL用于GC-MS进样；另1份用4 mL纯净水水洗，恢复到原始体积，水洗相使用真空旋转蒸发去除有机溶剂，用于味觉品评，选择强度较大的亚组分进行TDA分析。其中戊烷萃取水洗相命名为“B-X-I” (X是指1～10)，乙醚萃取水洗相命名为“B-X-II”，残留相标记为“B-X-III”。

1.3.6 TDA

根据感官评价结果(表 3)，对所有呈味亚组分(1～3 mL)分别用纯净水1∶1，1∶2，1∶4，……，稀释，进行品评，计算TD值。其中苦味用三角试验测定，涩味采用半舌测定[6]。

1.3.7 呈味化合物鉴定

对TD值较大的亚组分进行GC-MS分析，呈味化合物基于质谱库检索与标准品验证比对以及对标准品感官验证鉴定。

13.8 GC-MS条件

色谱柱：FFAP极性柱(60 m×0.25 mm×0.25 mm)，进样口温度250 ℃；升温程序：初温50 ℃，保持2 min，以6 ℃/min 速率升温至230 ℃，保持45 min；载气(He)，流速2 mL/min；进样1 μL，不分流进样。

质谱条件：离子源230 ℃，EI电离源，电子轰击能量70 eV，扫描范围为35～350 amu。

2 结果与讨论

2.1 真空旋转蒸发

通过真空旋转蒸发，将白酒样品分成挥发性组分和不挥发组分。感官品评结果表明，涩味、苦味和甜味主要集中在挥发性组分中(表 1)，这与葡萄酒[6]和啤酒[10]中的苦味和涩味物质不同。

表1 真空旋转蒸发分离白酒中挥发和不挥发物质的味觉评价Table 1 Sensory evaluation of the volatile and nonvolatile compounds in Baijiu separated by vacuum rotary evaporation

注：a：强度采用0～5六点强度法打分，0：没有感觉到；5：感觉很强烈。

2.2 梯度减压蒸馏

设置不同水浴加热温度(40、50、60、70、80、85、90℃)，探索最小真空度0.08 MPa条件下能蒸馏出液体的最低温度。实验发现，只有水浴温度达85 ℃之后，接收相才有液体馏出，故选取85 ℃作为水浴加热条件，对样品进行梯度减压蒸馏。

通过减压蒸馏分别接收到 A、B、C和D四个组分，对4个组分进行味觉品评(表 2)。组分A体积最大为61 mL，主要呈甜味，强度为3.0；组分 B体积最小，9 mL，但呈现了最强烈的涩味(4.6)和苦味(4.4)；组分C表现出较低的涩味(2.1)和苦味(1.8)强度;组分D主要呈现酸味(4.8)和轻微收敛的涩味(2.0)。基于感官品尝结果，重点研究组分B。

表2 梯度减压蒸馏分离组分A-D的味觉品评Table 2 Sensorial evaluation of fractions A-D from gradient vacuum distillation

2.3 味觉活性物质分离

为了减少干扰，方便挥发性呈苦、涩味化合物的鉴定，对组分B进行半制备分离，根据色谱峰收集到10个亚组分B-1～B-10。由于分离出的呈苦味和涩味的化合物是挥发性的，因此选用戊烷和乙醚分别进行萃取，收集每个亚组分的有机相，平均分成2份，1份进行GC-MS分析，另1份水洗后真空旋转蒸发除去溶剂进行味觉品评。

呈味化合物主要存在于乙醚萃取相中，即亚组分II中(表 3)，且既呈涩味又呈苦味。其中亚组分 B-8-II的苦味和涩味强度最大，分别为4.6和4；其次是亚组分B-2-II，强度分别为3.4和3.2；再次是亚组分B-3-II，强度分别为3和2.6。戊烷萃取相(亚组分I)几乎没有味觉活性；萃取后残留相(亚组分III)中的B-4-III、B-6-III和B-8-III呈现轻微的味觉特征。

运用三角试验和半舌试验对乙醚萃取相(亚组分II)进行TDA分析。TD值最大的是亚组分B-8-II(表 4)，涩味TD值128，其次是亚组分B-2-II，为64；第3是亚组分B-3-II，稀释32倍后仍能感受到涩味。此外，亚组分B-8-II也显示了最强烈的苦味，其TD值为32(表 4)，亚组分B-2-II和B-3-II的苦味TD值均为16，亚组分B-4-II的TD值为8。

表3 戊烷三乙醚溶剂萃取组分的味觉特征及强度Table 3 Taste qualities and intensity of the fractions from pentane-diethyl ether solvent extraction

注：a组分B-1～B-10：指从半制备分离得到的10个亚组分； I是指半制备组分的戊烷萃取相；II是指半制备组分的乙醚萃取相；III是指半制备组分萃取后的残留相。b表示没有明显味觉。

表4 乙醚萃取组分的味觉特征、味觉稀释(TD)值及呈味化合物的鉴定Table 4 Taste qualities, taste dilution (TD) factors and identification of the compounds from diethyl ether extraction fractions

注：a测定TD因子时，涩味采用半舌试验测定，苦味采用三角试验测定。

为鉴定呈苦、涩味化合物，对相关组分进行GC-MS分析(表 4)。所有解析到的化合物均通过标准品验证。在亚组分B-8-II中鉴定出3-甲基丁醇和2-苯乙醇。根据标准品味觉品尝验证，在水溶液中3-甲基丁醇既呈涩味又呈苦味，2-苯乙醇只呈涩味，2-苯乙醇的味觉特征是首次报道；亚组分B-2-II中鉴定出正丙醇、乳酸乙酯和糠醛，其中正丙醇、糠醛在水溶液中呈现苦味和涩味，乳酸乙酯只呈涩味；亚组分B-3-II和B-4-II都含相同的呈味化合物2-甲基丙醇和1-丁醇，它们都呈现苦味和涩味。这些化合物是白酒中常见的香气化合物[17-18]。部分化合物如正丙醇、1-丁醇、乳酸乙酯、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇和糠醛呈苦味和涩味特征与原先推测吻合[3, 19]。

3 结论

本研究以芝麻香型原酒为研究对象，首次建立了白酒中挥发性苦味和涩味化合物提取、分离、鉴定的方法。通过梯度减压蒸馏、半制备分离、溶剂萃取、TDA结合GC-MS，鉴定白酒中挥发性的呈苦、涩味化合物。采用此方法发现2-苯乙醇和乳酸乙酯在白酒中呈现涩味，而糠醛、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、1-丁醇和正丙醇同时呈涩味和苦味,其中2-苯乙醇是首次报道了其味觉特征。下一步将进行这些化合物苦涩味阈值测定，以及pH等对苦、涩味的影响研究。