有氧运动和抗阻运动对大鼠棕色脂肪组织形态及活性的影响

杨星雅 田野 冯葆欣 李鹏飞 房国梁 李良 于涛

1国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

2国家体育总局体育文化发展中心

在哺乳动物体内，主要存在着两种脂肪组织：白色脂肪组织（White adipose tissue，WAT）和棕色脂肪组织（Brown adipose tissue，BAT），共同维持机体能量代谢平衡。WAT是一种储能组织，以甘油三酯的形式储存能量。而BAT是一种耗能组织，可以通过产热的方式将能量消耗。一直以来，BAT在成人体内被认为是低功能的，而且由于数量少和分布局限，对人体代谢的作用是微不足道的[1]。但是近些年来的研究证明，在成人体内也存在着具有活性的棕色脂肪组织[2-4]，因此棕色脂肪组织可能对饮食导致的肥胖、胰岛素抵抗以及2型糖尿病等起到重要的预防作用。

BAT是一个强产热器官，其产热能力是肝脏的数十倍，也是肌肉的数倍[5]，它具有很强的适应外部刺激的能力，并通过非颤栗性产热的形式释放热量。刺激其产热的因素包括寒冷、交感神经及细胞分泌因子等[6，7]。产热机制主要是通过其线粒体内膜上的解偶联蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1），将脂肪酸氧化和ATP产生解耦连，使能量以热量形式散失，所以，UCP1是反映其产热能力的重要指标。PR结构域家族第16个成员（PR-domain-containing 16，PRDM16）是一种锌指蛋白，在棕色脂肪组织分化过程中起着正向调控作用，能促进棕色脂肪组织的形成，在棕色-白色脂肪组织形成过程中起“开关”的作用，即它可以促进棕色脂肪细胞中一些活性蛋白的特异性基因表达，并抑制白色脂肪细胞中一些活性蛋白的特异性基因表达[8]。过氧化物酶体增殖活化受体γ辅激活因子-1α（PPAR gamma coactivator-1α，PGC-1α）作为转录协同因子参与包括调节棕色脂肪组织产热等调控能量代谢相关的多种功能[9]，并可与PRDM16相互作用而促进线粒体生成和适应性产热基因的表达[10]。

运动作为科学有效的减肥方法，对BAT有着怎样的影响吸引了很多研究人员的兴趣。早在上世纪末就有学者对运动对棕色脂肪组织功能的影响开展了研究，但是研究结果并不一致。有研究认为，运动可以增加BAT前体细胞的募集，使UCP1表达增加，增强棕色脂肪组织的产热作用[11，12]；也有研究发现，长期的跑台训练可以显著降低大鼠棕色脂肪组织含量和UCP1的表达水平[13-15]；另外，还有学者认为，8周或9周的递增负荷跑台训练对大鼠棕色脂肪组织细胞UCP1 mRNA的表达水平无明显影响[16，17]。以上这些研究中，运动方案基本都是有氧运动，对于其他运动方式，如抗阻训练对棕色脂肪组织会产生怎样影响的研究较少，尤其在国内尚未见相关报道。2012年有研究显示，抗阻运动可以促进PGC-1α的亚型显著升高[18]，而PGC-1α可以促进棕色脂肪组织的活性，所以本研究主要从不同运动方式对棕色脂肪组织的影响这一点切入，建立大鼠的抗阻训练模型，对爬梯法抗阻训练以及跑台有氧训练对大鼠棕色脂肪组织的形态及活性的影响进行研究。

1 材料和方法

1.1 动物类型

6周龄雄性SD大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）30只，随机分为3组，每组10只，分别是安静对照组（C组）、有氧训练组（T组）和抗阻训练组（L组）。自由饮水进食，光照比为12 h∶12 h。适应性饲养1周后称重，开始进行为期8周的训练。

1.2 训练方案

1.2.1 抗阻训练方案（负重爬梯法）[[1919--2222]]

爬梯1.1×0.18 m，80°倾斜放置，顶部有一个小笼子供大鼠休息，负重装置固定于大鼠尾部。适应性训练：共3天，每天不加负荷让大鼠完成爬梯8次。正式训练：每轮训练包含4～8次的递增负荷爬梯训练。初始负荷为大鼠体重的50%，然后每次递增负荷30 g，直到大鼠成功爬梯8次或爬梯失败后停止本次训练，大鼠能够成功完成爬梯的最大负荷认为是本轮训练的最大负荷。下轮的训练开始先进行4次爬梯，负荷分别为前次最大负荷的50%、75%、90%和100%，如果大鼠能够完成这4次训练，在随后的爬梯训练中，每次递增负荷30 g，直到大鼠完成8次爬梯训练或爬梯失败后停止训练，同样以成功完成爬梯的最大负荷作为新的最大负荷，依次类推。同一只大鼠两次爬梯之间休息2 min。抗阻训练每3天进行1次，每只大鼠每次训练时间约为10～20 min，共进行8周。

1.2.2 有氧训练方案（跑台法）[[2222--2424]]

适应性训练：大鼠先进行1周的适应性训练，以减少正式训练时的压力，速度为10 m/min，每天训练10 min，连续适应训练5天。正式训练：第1周速度为15 m/min，训练20 min；然后在8周时间里，训练速度增至28 m/min，训练时间增至60 min；整个训练过程跑台坡度均为0°；每周一至周五训练，休息2天。

1.2.3 取材

选取各组中训练情况较好的8只大鼠，在最后一次训练结束48 h后将大鼠称重，10%的水合氯醛溶液腹腔麻醉，取肩胛下棕色脂肪组织，称重并记录后做好标记，取出一部分放入多聚甲醛中固定，其他组织立即放入液氮中迅速冷冻，然后放－80℃保存。

1.3 实验分析

1.3.1 形态学研究

取用多聚甲醛固定的组织，石蜡包埋切片，经HE染色，光镜下进行形态学检查，用imageJ软件对脂滴面积进行计算，在一个视野内取十个完整脂滴计算其平均面积。

1.3.2 荧光定量PCRPCR实验

取适量组织，放入预冷的玻璃匀浆器中，按照动物组织总RNA提取试剂盒（天根）说明提取总RNA，然后用反转录试剂盒（Takara）将RNA反转录成cDNA，然后利用从NCBI数据库中查找的相关基因的基因序列设计特异性引物（表1），进行SYBR GREEN法荧光定量PCR实验（Takara）。最后根据各反应孔的Ct值，用相对定量法算出各目的基因的相对表达量。

表1 目的基因的引物序列

1.3.3 WWestern bblloott实验

预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂。在蛋白抽提开始前加入0.1 M PMSF母液，PMSF终浓度1 mM。称取适量组织，以裂解液体积=1∶9比例加入裂解液，电动组织匀浆器15000 rpm转速进行匀浆，每次10 s，间隔10 s，进行3次匀浆。匀浆时EP管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20 min，4℃离心，13000 rpm，20 min。离心完成后取上清，在上清液中加入5×的蛋白上样缓冲液，放入煮沸10 min。SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白转至NC膜上，3%BSA-TBST封闭30 min，然后将膜与稀释好的一抗4℃孵育过夜（以β-tubulin作为内参。一抗均购自abcam公司，UCP1、PRDM16和PGC-1α抗体货号分别为ab10983、ab106410和ab54481，均为兔多克隆抗体，稀释倍数分别为1∶4000、1∶1000和1∶4000，内参抗体β-tubulin鼠单抗购自Immunoway公司，货号为YM3030，稀释倍数为1∶5000），次日TBST洗膜3次，每次5 min，洗去未结合的一抗，加二抗室温孵育1 h（二抗为山羊抗兔IgG，购自天德悦公司，稀释倍数为1∶10000），然后TBST洗膜6次，每次3 min，以洗去未结合的二抗，最后ECL加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光：10 s～5 min（曝光时间随不同光强度而调整），显影2 min，定影，使用ImageJ软件获取条带的灰度值。

1.4 统计方法

所有数据用SPSS统计软件进行统计分析，各指标数据以（均数±标准差）表示，三组间比较用单因素方差分析，两组数据比较用独立样本t检验，取P＜0.05作为有显著性差异判断标准。

2 结果

2.1 两种运动对大鼠体重的影响

训练前和训练后分别将大鼠称重，训练前三组大鼠的平均体重分别是：337.4±13.53 g，342.3±14.43 g，345.5±14.98 g，组间无显著性差异。将训练后体重减去训练前体重得出每只大鼠在8周时间里的体重增加量，对照组、有氧训练组和抗阻训练组的平均体重增加量分别是201±72 g，105±41 g和140±39 g，有氧训练后大鼠体重增量仅是对照组的52%，统计学检验有显著性差异（P＜0.01），抗阻训练后大鼠体重增量为对照组的70%（P＜0.05）。（图1）

2.2 两种运动对棕色脂肪组织重量的影响

训练后取肩胛下棕色脂肪组织称重，对照组、有氧训练组和抗阻训练组的脂肪组织重量分别是：0.39±0.14 g、0.28 ± 0.08 g、0.33 ± 0.10 g。两个训练组分别与对照组相比较均无显著性差异。

2.3 两种运动对棕色脂肪组织形态的影响

有氧训练后BAT的脂滴面积（158 ±52 μm2）与对照组（354±96 μm2）相比明显变小，且具有显著性差异（P＜0.01）；抗阻运动后脂滴面积（272 ±86 μm2）与对照组相比有所降低，但无显著性差异（P＞0.05）。（图2）

图1 各组大鼠体重增长量比较

图2 各组大鼠BAT脂滴面积比较

2.4 两种运动对BATBAT相关基因mRNAmRNA水平的影响

有氧训练后PRDM16的mRNA水平是对照组的1.78倍，并有显著性差异（P＜0.05），而抗阻训练后是对照组的1.30倍，无显著性差异；有氧训练后PGC-1α的mRNA水平是对照组的2.24倍（P＜0.05），抗阻训练后是对照组的1.25倍（P＞0.05）；有氧训练和抗阻训练后UCP1的mRNA水平分别是对照组的1.33倍和1.21倍，二者均无显著性差异。有氧训练后BAT相关基因的mRNA表达量有比较明显的升高，且高于抗阻训练。（图3）

图3 各组大鼠PRDM16、PGC-1α和UCP1 mRNA水平比较

2.5 两种运动对BAT相关蛋白水平的影响

有氧训练和抗阻训练后PRDM16蛋白的表达分别是对照组的1.46倍（P＜0.05）和1.08倍（P＞0.05），PGC-1α蛋白的表达量分别是对照组的1.56倍（P＜0.05）和0.94倍（P＞0.05），UCP1蛋白的表达量分别是对照组的和1.20倍（P＞0.05）和1.02倍（P＞0.05），结果显示有氧训练后PRDM16和PGC-1α蛋白显著上升，而UCP1蛋白有所上升，但是没有统计学差异，而抗阻训练后三种蛋白均无显著性差异。（图4）

图4 各组大鼠PRDM16、PGC-1α和UCP1蛋白表达比较

3 讨论

本研究对不同运动方式对大鼠BAT的形态和活性的影响进行了初步探索，除了对目前有文献报道的有氧运动对棕色脂肪的作用进行了验证之外，对抗阻运动对棕色脂肪组织的影响进行了研究，并得出了初步的结论。

3.1 有氧运动和抗阻运动对BATBAT的组织形态的影响

BAT主要由棕色脂肪细胞和细胞周围丰富的毛细血管和神经构成，含有大量的线粒体。其细胞形态与WAT仅含一个大脂滴并填充大部分胞质不同，BAT细胞含有多个脂滴，并且胞质内含有很多细胞器[25]。De Matteis[11]的研究表明，6周的有氧运动可极显著地减小BAT的脂滴面积。本研究中，有氧运动后BAT的脂滴面积也有显著减小，与前人研究结果较为一致。而抗阻运动后脂滴面积减小不明显。

3.2 有氧运动和抗阻运动对BATBAT的分化形成的影响

研究证明，经典BAT内细胞的起源与WAT细胞的起源并不相同，反而是与肌细胞的起源相同[26]。Seale等[8]通过实验发现，PRDM16是BAT和骨骼肌之间相互转化的“开关”，而且PRDM16还可以促进一些活性蛋白，如PPARγ、Cidea等在BAT中的高表达，抑制WAT相关活性蛋白如抵抗素（resisitin）等的表达[27，28]。另外，Uldry等[29]研究发现PRDM16基因的表达会诱导线粒体的生物合成和解偶联呼吸作用。所以，PRDM16在BAT细胞的发育过程中起着正向调控作用。

Xu等[12，33]的研究中，8周跑台运动（15 m/min，40 min/天，1周训练5天）可以使BAT中的脂肪前体细胞显著增加，分化正调控因子PRDM16显著升高，证明有氧运动对棕色脂肪细胞的分化形成有促进作用，这与本研究中结果较一致。而抗阻训练之后，PRDM16的基因水平和蛋白水平都有一定程度的升高，但不具有显著性差异。这表明有氧运动对棕色脂肪组织分化过程中的正调控因子有明显的促进作用，而抗阻运动的影响较小。

3.3 有氧运动和抗阻运动对BATBAT活性的影响

BAT的活性主要分两个方面——代谢活性和产热活性。脂肪组织本身作为一种分泌器官，在机体代谢中起着重要作用，PGC-1α是一种转录辅激活物，控制着氧化代谢相关基因的表达和线粒体的生物合成，并通过对解偶联蛋白的诱导和核呼吸因素的调节而影响氧化呼吸的作用，对BAT的代谢活性有着重要的调控作用，还可协同UCP1发生产热作用[30]；UCP1则与BAT的产热活性密切相关，UCP1在线粒体氧化呼吸的电子传递和三磷酸腺苷产生的过程中起解偶联作用，使脂质氧化产生大量能量以热能形式经血管输送到身体各个部位散发出去[31，32]，从而增加机体的总能量消耗。

研究发现，相对于安静对照组，8周跑台训练（15 m/min，40 min/天，1周训练5天）可以使BAT相关基因UCP1、PGC-1α等显著升高[12，33]，De Matteis[11]的研究发现，6周跑台训练（5次/周，60 min/次，速度18 m/min）可以使BAT中PGC-1α显著升高，而未影响UCP1的表达，这与本研究的结果比较一致。而抗阻训练之后，PGC-1α和UCP1的mRNA和蛋白水平都未出现显著性升高，这表明了有氧运动对棕色脂肪组织的代谢功能有明显的促进作用，并且对产热作用影响较小，而抗阻运动对BAT的代谢以及产热活性的影响都比较小。

本研究中的抗阻训练方案是参考其他领域研究所确定的，所以本研究中抗阻运动对BAT作用的研究结果存在着一定的局限性，仅仅是作为初步的探索，将来需对不同的运动方案进行探索，可能会出现不同的结果。

4 结论

8周的有氧跑台运动对BAT的组织形态、形成和代谢活性有显著的促进作用，对产热活性的促进作用较小；而8周的抗阻运动对BAT无显著影响。