甘薯几丁质酶的性质研究

张 健，王景景，谢逸萍，刘美艳

(1.江苏师范大学生命科学学院/整合植物生物研究所，江苏徐州 221116； 2.中国农业科学院甘薯研究中心，江苏徐州 221121)

甘薯(IomoeabatatasLam)属旋花科甘薯属，是重要的粮食、经济和饲料作物，在全世界范围内广泛种植[1-3]。我国是甘薯种植面积最大的国家，占世界种植面积的一半以上。甘薯黑斑病是危害甘薯种植和储藏的重要病害之一，在世界各地甘薯产区均有发病[4]。甘薯黑斑病使幼苗期和生长期苗茎基部黑根烂死，储藏期感染则会使薯块出现黑斑，味苦，最后全部腐烂[5]，使甘薯失去应用价值。甘薯黑斑病病原菌为CeratocystisfimbriataEllis et Halsted，属于真菌病害。植物病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PRs)是当植物体受病原菌等刺激物刺激后产生的一类蛋白质，正常情况下含量并不高，一旦被诱导，含量迅速增加从而提高植物对病虫害等逆境的防御抵抗能力[6-7]。国内外的研究表明，植物几丁质酶被认为是一类与植物抗病有着密切关系的病程相关蛋白，它参与了植物体内防御机制的很多方面[8-9]。大量研究表明，植物几丁质酶是一类次生代谢物，只有在真菌或病毒的诱导刺激下才会大量积累，积累到一定量时作用于真菌等病害，抑制其生长或直接将其杀死来提高植物的抗逆能力[10-12]。本试验的前期工作已经利用甘薯黑斑病病菌诱导甘薯大量表达了几丁质酶，说明甘薯黑斑病抗性与甘薯块根几丁质酶活性有相关关系。核黄素、脱乙酰几丁质、黑斑病病菌处理均能诱导甘薯块根几丁质酶活性的提高，说明甘薯几丁质酶是一种诱导酶。体外抑菌试验结果显示，甘薯几丁质酶对甘薯黑斑病病菌具有很强的抑制作用[13]。进一步研究甘薯几丁质酶的性质，能为甘薯抗黑斑病育种[14]、新型抗黑斑病药物的开发和生产上黑斑病的防治[15]提供理论根据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

甘薯黑斑病病菌、南京-92块根(高抗黑斑病品种)由江苏省徐州市农业科学院中国甘薯研究中心提供。

1.2 黑斑病菌孢子悬液的制备

取灭菌过的PDA液体培养基200 mL，接种甘薯黑斑病菌于其中，在(30±1) ℃下，以120 r/min振荡3 d，过滤除去菌丝，以3 000 r/min离心10 min，重复3次，直至沉淀基本为白色，经镜检确认为黑斑病菌内分生孢子，加适量水悬浮。试验时，将上述内分生孢子配成1×107个孢子/mL的浓度供接种用。

1.3 薯块染菌处理

试验时，选取大小均匀、表面光洁无病斑的块根，用蒸馏水冲洗3次。将块根切成1～2 cm厚的圆片，然后将黑斑病菌内分生孢子悬浮液涂于块根圆片的两侧，于(30±1) ℃暗箱中保温4 d。

1.4 甘薯几丁质酶的提取和活力测定

将甘薯外表层去除，切成小块，并迅速将其浸泡于 0.02 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液(pH值5.5)中，甘薯质量和缓冲液体积的比例为1 ∶1，用组织捣碎机将甘薯磨碎，4层纱布过滤，滤液于4 ℃下以8 000 r/min离心15 min，上清即为几丁质酶粗酶液。胶体几丁质的制备按照李世贵等的方法[16]进行。DNS溶液的配制按照李合生的方法[17]进行。几丁质酶活性测定参照Boller等的方法[7]进行。以每小时分解胶体产生1 μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。

1.5 甘薯几丁质酶的分子量测定

采用SDS-PAGE测定分子量，按蔡武成等的方法[18]进行。

1.6 甘薯几丁质酶的等电点测定

采用圆盘电泳，按蔡武成等的方法[18]进行等电点测定，两性电解质pH值为7～10。

1.7 甘薯几丁质酶的最适温度测定

分别于10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃下测定几丁质酶活性，3次重复。以温度为横坐标，几丁质酶活性为纵坐标，得出甘薯几丁质酶活性随温度变化的曲线。

1.8 甘薯几丁质酶的最适pH值测定

几丁质酶活性测定体系的pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。其中pH值2.0～6.5是用0.02 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH值7.0～12.0是用0.02 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。3次重复。以pH值为横坐标、几丁质酶相对活性为纵坐标，得出甘薯几丁质酶活性随pH值变化的曲线。

2 结果与分析

2.1 甘薯几丁质酶的分子量

从高抗甘薯黑斑病品种南京-92块根得到粗酶液。经热变性、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SephadexG-75凝胶层析纯化后，将有几丁质酶活性的条带进行10%、12%PAGE电泳，均显示为单一条带(图1)；说明制备得到了电泳纯级的甘薯几丁质酶单一组分。将割胶纯化后得到的几丁质酶进行SDS-PAGE电泳(图2)，根据低分子量标准蛋白计算可知甘薯几丁质酶相对分子量为23 ku。

2.2 甘薯几丁质酶的等电点

以凝胶距正极的距离为横坐标，每0.5 cm凝胶的pH平均值为纵坐标制作pH值梯度曲线(图3)。得出回归方程为y=0.253 2x+7.019 5，r2=0.992 9。几丁质酶经圆盘等电聚焦电泳得到1条蛋白带(图4)，圆盘等电聚焦电泳胶总长 8 cm，蛋白条带距负极端0.7 cm。根据等电聚焦的标准曲线确定等电点为pH值7.2，说明该蛋白为碱性蛋白质。

2.3 甘薯几丁质酶的最适温度

从图5中可以看出，甘薯几丁质酶在10～70 ℃之间都有较强的活性，45 ℃时酶活性达到最大，说明45 ℃为是甘薯几丁质酶的最适温度。

2.4 甘薯几丁质酶最适pH值

从图6中可以看出，甘薯几丁质酶在pH值4.0～10.0之间都有较强的活性，说明甘薯几丁质酶对于酸碱的耐受力较强；在pH值为2.0时，此酶完全失去活性，而在pH值为12.0左右时几丁质酶还保留一些活性；在pH值为5.5时，酶活性达到最大，说明pH值5.5为此酶的最适pH值。酶活性在pH值为6.5～7.5 之间下降，主要原因是pH值接近等电点，蛋白质发生部分沉淀，造成酶活性减小。

3 结论与讨论

本试验对纯化得到的甘薯几丁质酶的特性进行了研究。SDS-PAGE电泳显示甘薯几丁质酶的分子量在23 ku左右，这与已报道过的植物几丁质酶的分子量在20～40 ku之间的结果一致。本试验结果表明，甘薯几丁质酶最适反应温度为 45 ℃，在20～70 ℃时比较稳定，当温度超过75 ℃，酶的活性急剧下降；该酶的最适pH值为5.5，在pH值为4.0～10.0比较稳定，说明纯化的这种甘薯几丁质酶对酸碱的耐受性较强，当pH值小于或等于2.0时几丁质酶失去活性，pH值超过12.0时活性接近于0；该几丁质酶的等电点为7.2，为碱性几丁质酶，这与在甘蔗[19]和中国水仙[20]中分离得到的几丁质酶的研究结果一致。

本试验只纯化了一种甘薯几丁质酶，由外切几丁质酶活性测定方法可知，这种几丁质酶为外切几丁质酶。很多研究表明，植物体内可能存在不止一种几丁质酶[21]，本试验的目的是要获得对甘薯黑斑病病菌有较强抑制作用的几丁质酶，并且通过体外抑菌试验证明这种几丁质酶对黑斑病有较强的抑制作用，对甘薯体内可能存在的其他同工酶将作进一步的研究。