闽西地区仔猪病毒性腹泻流行情况调查

董 波，张寄香，戴爱玲，李晓华，李静楠，杨小燕

(1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012； 2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩 364012；3.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128)

猪病毒性腹泻病是由1种或多种病毒单独或混合感染各年龄段猪所引发的伴有腹泻、呕吐和脱水等典型症状的消化道机能紊乱疾病[1]。猪病毒性腹泻病主要表现为病猪体温正常或稍高、精神沉郁、食欲减退或废绝，常常导致猪群生长发育迟缓，死亡率升高，给养猪业造成重大经济损失，严重阻碍畜牧行业发展。因此，了解仔猪病毒性腹泻病的流行局势，有助于更有效的施行防治措施。

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus，RV)是引起猪病毒性腹泻的3种主要病原，均具有较强的传染性，哺乳仔猪的易感性最强，致死率高[2]。3种病毒皆为接触性传播，在致病性和流行病学上极为相似，皆以呕吐、腹泻、脱水为主要特征，临床上不易分辨。

近年来，PEDV在我国多个省(市、区)的发病率呈上升趋势，是困扰养猪业的主要疾病之一。2011年张世忠等对福建省各个地区的规模化养猪的顽固性腹泻病例进行检测，PEDV感染率高达52.2%[3]。然而，部分病例存在2种或3种病毒混合感染的情况，对养猪业的潜在危害不容忽视。因此，本研究将2014年1月至2016年12月期间送至龙岩学院动物医学研究所的135例疑似患有病毒性腹泻仔猪的组织样品采用RT-PCR进行诊断，分析闽西地区猪病毒性腹泻的流行状况，以期为病毒性腹泻的防控提供资料依据。

1 材料与方法

1.1 样品

收集2014年1月至2016年12月福建龙岩及周边地区规模化养猪场送往龙岩学院动物医学研究所进行诊断，患有腹泻的仔猪肠道组织及内容物，共计135份。

1.2 主要试剂

DL 2000 Marker、总RNA提取液(TaKaRa RNAiso Reagent)、病毒RNA/DNA提取试剂盒(TaKaRa miniBEST Viral DNA/RNA extraction Kit Ver.3.0)、AMV反转录酶、rTaqDNA聚合酶、Oligo(dT)、dNTP、DNA Marker DL 2000、RNA酶抑制剂、pMD19-T Vector购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel extraction Kit)及质粒提取试剂盒(Plasmid Miniprep Kit)购自爱思进生物技术有限公司产品；感受态细胞制备试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；三氯甲烷、异丙醇采用分析纯试剂。

1.3 引物设计与合成

参考GenBank上发表的PEDV、TGEV、RV基因序列，使用Premier Premier 5.0生物软件设计合成特异性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物详情见表1。

表1 引物序列

1.4 一步法RT-PCR

按照病毒RNA/DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)提供的操作手册，自小肠组织及内容物中提取总RNA并作为模板，进行PCR扩增。PCR反应程序：45 ℃作用30 min，94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次；72 ℃延伸10 min。产物经电泳分离，在凝胶成像系统下记录结果。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

产物经凝胶电泳鉴定，结果获得与预期大小相同的片段(图1)。将纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体，转化入DH5α感受态细胞，涂板过夜，挑取单个菌落，提取质粒，将阳性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列结果正确。

2.2 PEDV、TGEV和RV的感染情况统计

对PEDV、TGEV和RV的感染情况进行统计显示，PEDV的检出率最高，达到30.37%，而TGEV和RV的检出率分别为13.33%和11.11%(表2)。

表2 PEDV、TGEV和RV的感染情况

2.3 PEDV、TGEV和RV感染的季节性分布

3种病毒全年均被检出，PEDV和RV在冬季感染率较高，阳性检出率分别达到45.95%和16.22%，TGEV在春季的感染率相对其他季节较高，其阳性检出率为17.65%(表3)。

表3 各季节仔猪腹泻病毒阳性检出率统计结果

2.4 PEDV、TGEV和RV年份分布

对各年份阳性检出率进行统计，结果显示，PEDV的阳性检出率在2015—2016年间有所下降，仔猪流行性腹泻病的流行有所减缓；TGEV阳性检出率从2014—2015年期间有明显下降，至2016年又出现小幅提升；RV的阳性检出率变化不明显，波动平缓(表4)。

表4 各年份阳性检出率统计

3 讨论与结论

本研究自2014年1月至2016年12月对闽西地区部分规模化猪场中疑似患有病毒性腹泻疾病的样品进行诊断，数据统计得出，闽西地区PEDV、TGEV、RV的阳性检出率依次为30.37%、13.33%和11.11%；PEDV和RV混合感染、TGEV和RV混合感染、PEDV和TGEV混合感染和3种病毒均被感染的阳性检出率分别为3.70%、2.22%、0.74%和 0.74%，与我国其他地区检出率相近[4-5]。已有报道指出，在2012—2013年期间，闽西地区PEDV、TGEV、RV的阳性检出率分别为22.9%、25.0%、14.6%[6]。对比本研究统计数据发现，TGEV和RV的阳性检出率有所降低，PEDV的感染率有一定升高，3种病毒混合感染的比例有所降低。同时，相比全国近年来猪感染腹泻病毒的流行情况，闽西地区的TGEV、RV的阳性率均处于较低水平，而PEDV的阳性率仍然高于部分省(市、区)，应当加强防控[7-8]。

本研究中3种腹泻病毒在1年中均被检出，其中PEDV在冬季检出率最高，为45.95%。春、夏和秋季的检出率分别为26.47%、20.00%、2.00%，冬、春2季PEDV的检出率明显高于夏、秋2季，这一结果与PEDV在寒冷季节尤其在冬春季多发的流行特点相吻合，与我国部分地区的检出情况相似，说明寒冷季节有利于PEDV的感染与传播[9]。RV在春、夏、秋季的检出率分别为7.35%、13.33%、13.33%，在冬季检出率最高，达到16.22%，与往年闽西地区检出情况相比，RV在冬季的检出率呈现出上升趋势，而在春、夏、秋季，RV的感染情况没有明显变化。TGEV的检出率与全国大部分地区的情况相近，与2012—2013年闽西地区TGEV感染情况相比，检出率有所下降[6]。通过对不同年份阳性检出率统计发现，闽西地区PEDV感染率在近些年呈现下降趋势，感染情况有所好转。TGEV在2015年后感染率下降显著，并保持较为稳定的感染情况。而RV的感染率总体波动不大，这也与我国部分省(市、区)RV感染情况相近。

本研究显示，当前闽西地区以PEDV最为流行，对养殖业影响较大，造成经济损失更为严重，应当受到高度重视。同时，TGEV和RV的感染率虽然相对较低，仍然应当加强防控，不可掉以轻心。因此，在养殖中应当加强预防力度，通过合理使用药物提高猪群抵抗力，做好免疫接种[10]。从流行特点来看，病毒的流行与季节气候有一定联系，一般在冬、春季较寒冷潮湿的时期多发。冬、春季节由于气候多变，湿度大，作为传染源的粪便、乳汁和呼出的气体等在潮湿的环境下更容易传播病毒，携带病毒的传染源污染环境、饲料、饮水和用具，转而传入易感群体的消化道和呼吸道[11]。因此，冬春2季更要谨防病毒的滋生，减少应激，提高饲料营养，改善饲养管理，严格维持舍内干燥清洁，定期消毒通风。同时，应适当调整猪舍密度，以便降低传播速度，对于哺乳仔猪更应加强护理。