阿莫西林在农杆菌介导甘蓝型油菜遗传转化中的使用和优化

石文慧，安 然，郭海霞，张金文，，王朋宝，曹 智，王志伟，乔 岩

(1.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070； 2.甘肃省干旱生境作物学重点试验室，甘肃兰州 730070；3.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点试验室，甘肃兰州 730070)

甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)是重要的油料作物，30多年来油菜转基因研究得到了迅速发展，以转基因技术为核心的生物技术被誉为第二次“绿色革命”。陈锦清等育成的高含油量转基因油菜超油1号、超油2号新品系是目前世界上含油量最高的甘蓝型油菜[1]。何业华等将Bt基因导入甘蓝型油菜湘油13号，现已获得遗传稳定的抗虫油菜新品系[2]。但转化过程中，植物组织与携带目的基因的根癌农杆菌共培养后，往往难以抑制和脱除农杆菌，使得外植体成活率下降，愈伤诱导率和芽再生率降低，转化效率偏低，从而限制转基因技术的广泛利用，影响油菜育种水平的提高和新基因的功能分析鉴定。因此，为实现高效的遗传转化，有必要找到一种高效抗生素，在有效脱除农杆菌的同时，减少对愈伤诱导和芽再生的抑制作用，对于甘蓝型油菜遗传转化具有重要的应用价值。

农杆菌介导法已成为油菜等芸薹属植物基因转化中最常用的方法。目前为止，已先后在甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜等作物上实现了报告基因、抗除草剂基因、抗病虫基因、雄性不育基因、改良油菜成分和蛋白组分基因等的遗传转化。2004年山西农业大学利用花粉介导法将GUS基因转入油菜，其转化频率高达2.8%，逐步建立甘蓝型冬油菜花粉介导转化的新体系[3]。卢爱兰等将芜菁花叶病毒基因导入油菜，获得对油菜黄化花叶病毒(TuMV)抗性[4]。2014年徐茜育成了具有抗草甘膦基因的甘蓝型油菜新品种浙大619[5]。石东乔等将反义油酸脱饱和酶基因(Fad2基因)导入油菜，获得了高油酸含量，低亚油酸、亚麻酸的转基因油菜[6]。长期以来，农杆菌介导的遗传转化采用的抑菌剂多为羧苄青霉素和头孢霉素，因为它们可以抑制原核生物细胞壁的生成，进而抑制细菌。关于羧苄青霉素(carbenecillin)和头孢霉素(cefotaxime)对油菜转化的研究已有报道[7]，裴冬丽等在白菜型油菜的转化中发现这2种抗生素对农杆菌菌株LBA4404有很强的抑制作用[8]。高武军等研究发现500 mg/L的羧苄青霉素可以完全抑制农杆菌的生长[9]。Han等在小麦的遗传转化中发现头孢霉素在250 mg/L可以完全抑制农杆菌生长[10]。在高梁遗传转化中发现250～500 mg/L的羧苄青霉素可以有效抑制农杆菌[11]。但是，以上研究并没有分析头孢霉素和羧苄青霉素对植物再生潜力的影响。有研究认为头孢霉素可能会抑制芽的分化[12-14]，而羧苄青霉素则抑制根的形成[15]。此外，抗生素的浓度对遗传转化也有一定的影响。如浓度为250 mg/L的头孢霉素不利于玉米愈伤组织的形成[16]，并最终导致转化效率反而低于100 mg/L的处理；羧苄青霉素在随后的试验中都采用100 mg/L来抑制农杆菌[17]。特美汀(timentin)和阿莫西林(amoxicillin)是应用于农杆菌介导的植物遗传转化中的新型抗菌素，特别是在胚性愈伤组织再生系统中具有很好地抑菌效果，而且对组织再生的抑制较小。Costa等在农杆菌介导烟草的转化中发现特美汀具有较高的转化频率并对根的生长具有促进作用[18]。胡威研究柑橘时发现特美汀降低了芽的再生频率，导致70%的再生芽产生突变，而在阿莫西林的培养基中是正常的[19]。阿莫西林是一种无菌单独包装、稳定且便于携带的抗生素，其价格相对于羧苄青霉素、头孢霉素、特美汀便宜。2014年Naing等首次研究了阿莫西林对“鲜红”菊花[Chrysanthemummorifolium(Ramat)]叶片外植体培养的植株再生能力的影响，发现250 mg/L的阿莫西林不但可以抑制农杆菌菌株LBA4404，而且对外植体具有高效的转化频率，证明了阿莫西林可有效取代羧苄青霉素或头孢霉素[20]。但阿莫西林应用于农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化中并未见报道。

因此，本研究在油菜种质遗传转化过程中，设置4种不同浓度的抗生素，以确定适合于甘蓝型油菜农杆菌介导的抗生素种类和浓度，并明确阿莫西林在甘蓝型油菜遗传转化中的效果，这对于提高农杆菌介导的油菜遗传转化效率、加快油菜种质资源创新具有重要的理论价值和应用前景。

1 材料与方法

1.1 试验材料与药品

以甘蓝型油菜杂交种青杂5号的恢复系“1831R”为试验材料。农杆菌菌株选用LBA4404、GV3101。植物表达载体为pCAMBIA1300(图1)，该载体使用草甘膦抗性基因EPSPS(5-enolpyruvy lshikmate-3-phosphate synthase，5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)替换了pcAMBIA1300的潮霉素抗性标记Hyp(图1)。羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、阿莫西林(Amo)、Kan、Rif、AgNO3、AS、6-BA、2，4-D、NAA、草甘膦均用0.22 μm的滤膜抽滤。

1.2 方法

1.2.1 外植体的制备 外植体制备参照邹智等的研究方法[21]。选取籽粒饱满的种子，70%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗2～3次；1%的次氯酸钠溶液(0.3 g+30 mL H2O2)浸泡 13～15 min(期间不时摇动)，无菌水冲洗3～5次；接种于萌发培养基上，每瓶约20粒种子，置培养箱培养诱导萌发，培养条件如下：温度(25±3)℃下，光照16 h/d，光强2 000 lx萌发。4～5 d后切取其下胚轴，转接于预培培养基。

1.2.2 含表达载体pCAMBIA1300的农杆菌菌株LBA4404、 GV3101的活化 参照王关林等所述的方法[22]。(1)取出含表达载体pCAMBIA1300的农杆菌菌株LBA4404划线接种于含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP固体培养基平板上，28 ℃ 下倒置黑暗培养2～3 d。(2)于转化前1 d挑取单菌落，接种于20 mL含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP液体培养基中，置于摇床上28 ℃下200～210 r/min培养过夜(16 h 左右)，使菌体达到对数期(D600 nm=0.6～0.8)。(3)取400 μL菌液转接入20 mL无抗生素的YEP液体培养基中，继续培养4～6 h。(4)将菌液倒入无菌带盖的50 mL离心管内，盖上管盖，用封口膜封口，4 000 r/min离心5 min。(5)取出离心管，在超净工作台上弃去上清，向离心管内加入适量MS液体培养基，悬浮起菌体，28 ℃下210 r/min离心，使其吸光度达到0.4～0.6 之间，即可用作接种外植体的工程菌液。农杆菌GV3101的活化等同。

1.2.3 外植体的农杆菌侵染 将预培2～3 d的下胚轴置于无菌的小培养皿中，向皿中倒入制备好的工程菌液，中间轻缓晃动数次，3～5 min后倒掉菌液，然后将下胚轴投入无菌水中清洗3遍，置于无菌滤纸上，吸干表面液滴，随即转移到共培养培养基(不含抗生素和草甘膦)中，25 ℃下黑暗培养2 d。

1.2.4 4种抗生素对抑制2种土壤根癌农杆菌菌株的作用 试验设计2个处理，即将500 mg/L 4种抗生素(Carb、Cef、Tim、Amo)分别加入2种土壤根癌农杆菌菌株的YEP培养基(分别挑取农杆菌菌株LBA4404、GV3101的单菌落于25 mL含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP液体培养基中)，置于摇床上28 ℃下200～210 r/min培养过夜(16 h左右)，2种土壤根癌农杆菌菌株的YEP培养基不加任何抗生素设为对照，然后分别测其吸光度。

1.2.5 抗生素浓度设计和抑菌效果鉴定 试验设计4个处理，每个处理设6个浓度梯度，即100、200、300、400、500、600 mg/L，每个处理设置3次重复。将农杆菌菌株LBA4404侵染后共培养2 d的外植体转入抑菌培养基。培养基经高压灭菌后，按试验设计分别添加不同浓度的抗生素，于植物培养箱中培养，培养条件为28 ℃、16 h/8 h光周期、光照度 2 000 lx。在培养3 d后连续观察抑菌情况。抑菌完全的标准为外植体在与培养基接触的部位未出现农杆菌菌落。抑菌率=未孳生农杆菌的外植体数/农杆菌侵染后的总外植体数×100%。

1.2.6 抗生素对芽再生的影响鉴定 在抑菌7 d之后，采用杨长友等报道的愈伤诱导培养基(MS培养基，含4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3，NAA、AgNO3、灭菌后另加)[23]，培养基经高压灭菌后，按“1.2.5”节设计的抗生素浓度梯度，分别添加，同时设置对照试验，即外植体(未经农杆菌侵染)在愈伤诱导过程中不加抗生素，28 ℃、16 h/8 h 光周期、光照度2 000 lx培养20 d后连续观察愈伤诱导情况。采用王俊生等报道的愈伤分化培养基(MS培养基，含2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，NAA灭菌后另加)[24]。培养基经高压灭菌后，按“1.2.5”节设计的抗生素浓度梯度，分别添加，同时设置对照试验，即外植体(未经农杆菌侵染)愈伤分化过程中不加抗生素，培养条件为28 ℃、16 h/8 h光周期、光照度2 000 lx，培养15 d后观察芽再生情况。芽再生率=带芽外植体数/总外植体数×100%

1.2.7 草甘膦抗性筛选及PCR检测 试验设计4个处理，即依据“1.2.6”节试验结果分别在芽再生培养基加入4种抗生素各自相对应的最适浓度，每个处理设置3次重复。同时加入抗性筛选试剂草甘膦(Gly)，浓度为8 mg/L。芽再生培养基为MS培养基，含4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+8 mg/L Gly，NAA、抗生素灭菌后另加。15 d后统计拟转基因植株，并进行PCR验证，统计转化率。转化率=转基因植株总数/总外植体数×100%。

用CTAB法提取拟转基因植株和对照(未转化植株)的基因组DNA，用于PCR扩增。

EPSPS基因的PCR引物为5′-TCTACAAATCTATCTC-TCTCG-3′、5′-GGAACTACTCACACATTATTA-3′。

产物长度为1 350 bp，建立25 μL反应体系：ddH2O(17.5 μL)、10×PCR Buffer(2.5 μL)、dNTP Mixture(2.0 μL)、上游引物(0.75 μL)、下游引物(0.75 μL)、TaKaRaTaq(0.5 μL)。PCR反应条件为95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52.9 ℃ 30 s，72 ℃ 81 s，30个循环；72 ℃ 8 min。反应结束后，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2003和SPSS 19.0进行处理。

2 结果与分析

2.1 4种抗生素对抑制根癌农杆菌的效果

500 mg/L的4种抗生素对抑制根癌农杆菌菌株(LBA4404、GV3101)的效果如图2所示。结果显示，加入羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、阿莫西林(Amo)的液体YEP培养基吸光度都为0。在对照试验中，吸光度在正常值(0.6～0.8)之间。说明浓度为500 mg/L的4种抗生素均有抑制农杆菌菌株LBA4404、GV3101繁殖和生长的效果，可以用于后续试验。

2.2 4种不同浓度抗生素在MS固体培养基上的抑菌效果

如图3所示，4种抗生素浓度在500～600 mg/L对抑菌率的影响差异不显著，而在100～400 mg/L对抑菌率的影响差异显著。其中，100 mg/L时，Carb比Cef、Tim、Amo抑菌率高151.11%、303.57%、32.94%，Amo比Cef、Tim抑菌率高88.89%、203.57%；200 mg/L时，Carb比Cef、Tim抑菌率高37.65%、105.26%，Amo比Cef、Tim抑菌率高88.89%、203.57%；300 mg/L时，Carb比Tim抑菌率高50.63%，Amo比Tim抑菌率高49.37%；400 mg/L时，Carb比Tim抑菌率高10.78%，Amo比Tim抑菌率高8.01%。表明较高浓度(500～600 mg/L)抗生素处理下，4种抗生素都可以很好地抑制农杆菌的生长。同时，浓度低于500 mg/L时，Carb抑菌效果最好，其次是Amo，再次是Cef、Tim。

以Amo为例，共培养7 d后发现，当浓度在400～600 mg/L 时，其抑菌效果如图4-a、图4-b、图4-c所示，接种下胚轴的培养基中未见农杆菌孳生；当浓度为300 mg/L时，培养基中虽未见农杆菌孳生，但下胚轴少许脱水且与培养基接触的部位呈水渍状，褐化较严重，活性降低，如图4-d；当浓度为100～200 mg/L时，下胚轴基部出现大量农杆菌菌落，菌落数与抗生素浓度呈反比。

2.3 4种不同浓度的抗生素对芽生长的影响

4种不同浓度的抗生素对芽生长的影响不同(图5)。从总体趋势来看，随着4种抗生素浓度的增加，芽再生率呈先增加后降低趋势，其中浓度在300 mg/L时达到最大；且在相同浓度下，经Amo处理的芽再生率最高，其次为Carb、Tim、Cef。当Amo浓度在100～200 mg/L时，比相同浓度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高3.62%、13.86%、14.05%；当Amo浓度在300 mg/L时，比相同浓度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高 1.86%、9.76%、9.76%；当Amo浓度在400～600 mg/L时，比相同浓度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高1.29%、9.53%、8.98%。由以上结果可知，4种抗生素中阿莫西林浓度在300 mg/L 时最适于芽再生。

以Amo为例，其不同浓度对愈伤诱导芽再生的影响不同，Amo浓度在300～600 mg/L下时，可以发现随着浓度的增加，经愈伤诱导芽再生的数量在明显下降，当浓度增加至600 mg/L时，愈伤组织停止生长而且生长出毛根，这表明高浓度的抗生素可抑制愈伤组织芽的再生。图6中e～h是第35天时4种抗生素浓度在300 mg/L时对愈伤诱导芽再生的生长状况。经Amo处理的芽的生长要优于Cef、Tim，而与Carb处理的芽的生长状况差异不大；经Cef处理的愈伤组织分化的再生芽呈现玻璃化现象；经Tim处理的愈伤组织出现绿点，但并未分化出芽。

2.4 草甘膦抗性筛选及PCR检测

500个总外植体，经草甘膦抗性筛选，转化过程使用Carb的拟转化植株18株；使用Cef的拟转化植株13株；使用Tim的拟转化植株8株；使用Amo的拟转化植株25株。提取拟转化植株的DNA，以质粒pCAMBIA1300为阳性对照，以未转化植株为阴性对照，进行PCR扩增(图7)，统计转化效率(图8)。

试验发现使用Carb的拟转化植株18株中经PCR扩增得到6株与预期长度一样的扩增产物，转化效率为1.2%；使用Cef的拟转化植株13株中经PCR扩增得到3株与预期长度一样的扩增产物，转化效率为1.0%；使用Tim的拟转化植株8株中经PCR扩增未得到与预期长度一样的扩增产物；使用Amo的拟转化植株25株经PCR扩增得到10株与预期长度一样的扩增产物，转化效率为1.9%。Amo比Carb、Cef转化效率分别高58.33%、90.00%。而阴性对照未扩增到相应的片段。初步证明EPSPS基因已成功导入到甘蓝型油菜恢复系中，且说明转化过程适用Amo的转化效率是最高的。

3 讨论与结论

本研究表明，在甘蓝型油菜杂交种青杂5号的恢复系“1831R”的遗传转化过程中，采用新型的抗生素制剂，包括了农杆菌介导的植物转化中常用的抗生素[羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)]和尚未广泛应用的新型抗生素[阿莫西林(Amo)、特美汀(Tim)]，以转化再生植株表现为依据，研究4种抗生素对农杆菌的脱除效果以及对油菜再生植株转化率的影响，发现转化初期，较高浓度(500～600 mg/L)抗生素处理下，4种抗生素都可以很好地抑制农杆菌的生长，浓度低于500 mg/L时，Carb抑菌效果最好，其次是Amo，再次是Cef、Tim。周小梅等在研究9种抗生素的抑制效果时发现Carb在500 mg/L、Cef在600 mg/L时对农杆菌菌株LBA4404、EHA105可以达到很好的抑菌效果[7]，本研究结果与之类似。Gould等在松树遗传转化中也得到类似的研究结果[25]。Naing等在菊花的研究中发现，Amo在250 mg/L可以完全抑制农杆菌菌株LBA4404的生长[20]。黄昌蓉在研究甘蓝型油菜早熟基因遗传转化体系的建立时发现，分化培养阶段500 mg/L的Tim难以控制农杆菌的生长，会导致外植体全部褐化，然后死亡[26]，但本研究发现，Tim在400 mg/L时可以达到很好的抑菌效果，这可能与农杆菌侵染的菌液浓度和时间有关，而本研究与Cheng等研究烟草遗传转化中的结果[27]类似。

抗生素不仅对农杆菌有抑制作用，而且对芽再生也有一定的影响。适宜的抑菌剂既要对农杆菌具有良好的抑制作用，又不能对外植体生长产生较大影响[28]。在芽再生阶段，随着4种抗生素浓度的增加，芽再生率呈先增加后降低趋势，其中浓度在300 mg/L时达到最大。且在相同浓度下，经Amo处理的芽再生率最高，其次为Carb、Tim、Cef。Naing研究发现Carb和Amo对芽再生的影响比Cef小，本试验结果与之一致。Ren在研究柑橘的遗传转化中发现经阿莫西林处理的愈伤组织诱导芽再生的频率优于特美汀处理[19]，本研究结果与之一致。Cef和Tim在不同浓度下诱导愈伤组织产生再生芽数量低于Carb，这与前人在疫苗、结球甘蓝、玉米中的研究结果[15-19]类似。经草甘膦抗性筛选及PCR检测，转化体系中使用Amo的转化效率比Carb、Cef转化效率分别高58.33%、90.00%。

综上，阿莫西林是甘蓝型油菜杂交种青杂5号的恢复系“1831R”遗传转化中最适的抗生素。羧苄青霉素、头孢霉素、阿莫西林、特美汀对后续再生芽生根能力是否有影响，以及残留的抗生素是否会影响转化植株移栽至大田后的生长，有待进一步研究。