短丝木犀种子成熟过程中的超微结构观察

杨国栋，钱慧蓉，陈　林，王贤荣

（南京林业大学 a.南方现代林业协同创新中心；b.生物与环境学院，江苏 南京 210037）

种子是祼子植物和被子植物特有的繁殖体，对延续物种起着重要作用。被子植物个体发育过程中，胚的发育是在母体内完成的，伴随胚的发育，同时发生着胚乳和其他营养物质的形成。在这一过程中外部种皮形态结构特征也发生变化[1]。种皮是种子适于传播或抵抗不良条件的结构，为植物的种族延续创造了良好的条件；同时维持种子内部的形态建成[2-3]，并且参与调节与种子休眠和萌发有关的生理活动[4-5]。而在种子内部进行着一系列的生物化学变化，为种子的休眠创造了一定的条件。种子休眠，是有生命力的种子由于胚或种壳的因素在适宜的环境条件下仍不能萌发的现象。休眠是植物在长期系统发育过程中获得的一种抵抗不良环境的适应性，是调节种子萌发的最佳时间和空间分布的有效方法[6-7]。

短丝木犀Osmanthus serrulatus又名宝兴桂花，为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus特有的春季开花种之一，具有较高的生态和园林价值[8]。但由于其独特的生境需求和长期以来的人为干扰，短丝木犀呈片段化破碎分布，近年来仅在四川的西岭雪山、峨眉山、东拉山、汉源、金口河等地区海拔1 800～2 000 m的山地林中有所发现，其中东拉山集中分布于海拔1 900 m的短丝木犀种群是迄今为止发现的面积最大的野生桂花种群。

短丝木犀是非常罕见珍贵的野生桂花资源，极具观赏价值，但是由于其数量少，分布范围狭小，且种子在自然生境下有隔年萌发现象，林下更新困难，其种质资源亟待保护。但目前对短丝木犀的研究非常少[9-11]，尤其是对其种子的研究寥寥无几。

通常种皮的机械障碍和种胚发育过程中内源萌发抑制物等是引起种子休眠的主要因素[12-13]，而短丝木犀的种子在萌发过程中也存在生理后熟的现象。但休眠过程中短丝木犀种子的种皮特性、种胚发育状况及内源抑制物质变化情况尚不明确[14]，而这种变化过程与种子休眠的形成有着直接联系[15-16]。本研究借助显微电镜技术，着重研究其成熟过程种皮和胚乳的超微结构变化，以期了解短丝木犀种子休眠产生的原因，找到更好地解除种子休眠的方法，为短丝木犀种质资源的保护研究和推广应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　实验材料及处理

短丝木犀实验种子采集于四川省雅安市宝兴县东拉山大峡谷。实验前先对采收的短丝木犀种子进行X-光检测和TZ染色实验，测试质量和活力。然后密封后放入冰箱进行干燥低温处理，以备长期保存。实验时取保存良好的、生活力后符合质量要求的短丝木犀种子进行自然层积处理。

1.2　种皮及胚乳的电镜观察

1.2.1种皮结构的扫描电镜观察

考虑到短丝木犀的原始生境，在室内培养箱中模拟短丝木犀自然生境下的温度和湿度条件，对其种子进行自然层积。从2014年9月20日开始对短丝木犀种子自然层积，于2015年4月、8月、12月和2016年4月、8月取样，具体时间为每月的15号，共取6次。通过扫描电镜对短丝木犀胚根端种皮的表面和内部结构拍照。通过扫描电镜（SEM）对短丝木犀种子中间部位及子叶末端种皮的纵切面结构进行观察并拍照[17]。

1.2.2胚乳的透射电镜观察

取自然层积处理的短丝木犀种子（同上），用液氮处理后横断切开，观察近胚根处和中部，通过透射电镜（TEM）对胚乳超微结构的变化进行观察并拍照[18]。

2　结果与分析

通过X-光检测和TZ染色实验检测短丝木犀种子的质量和活力（如图1a、1b）。结果显示：短丝木犀种子平均饱满率为60%，平均生活力为73%，满足种子活力的基本要求，可以进行相关实验，同时也能确保该批种子长期保存，以便后期实验。

2.1　自然层积短丝木犀种子种皮扫描电镜观察的结果

2.1.1胚根端种皮结构的观察结果

对短丝木犀种子胚根端种皮进行扫描电镜观察，结果显示，短丝木犀种子种皮表面、内部均含有蜡质，且随着种子逐渐成熟，蜡质不断增加。自然层积6个月后，种皮表面蜡质开始积累，但数量较少，色泽暗淡，种皮内部开始形成形状较小、颜色较浅的蜡质颗粒（见图2-a）；10个月后，种皮表面开始形成蜡层，但蜡层较薄呈下凹状态（见图2-b）； 12个月后，短丝木犀种子的种皮表面和内部的蜡质不断增加，表面凸起了颗粒状蜡质，蜡层也显著增厚（见图2-c）；16个月后，种皮表面蜡质浓度进一步增加，积聚形成许多凸起的颗粒，蜡层显著加厚，种皮内部蜡质也不断增多、增大，并逐渐板结（见图2-d）；19个月后，种子已经接近成熟，种皮表面凸起的蜡质颗粒被逐渐覆盖，蜡层开始基本成形（见图2-e）；23个月后，种子表面蜡层已经完全成型，蜡质分布均匀，种皮内部蜡质颗粒也进一步增大并板结，形成不规则蜡块（见图2-f）。在整个种子发育成熟的过程中，种皮表面和内部的蜡质颗粒都不断增多、增大，蜡层不断积累加厚。

图1　短丝木犀种子检测Fig. 1　The results of seed detection

2.1.2中间部位及子叶末端种皮结构的观察结果

对短丝木犀种子中间部位及子叶末端种皮进行扫描电镜观察，结果发现，在种子发育初期（图3-a），中间部位的种皮主要由几层不同形态的薄壁细胞组成，随着种子发育成熟，栅栏层不断分化发育。

图2　低温层积短丝木犀不同时期种皮胚根端的表面结构Fig. 2　The surface structure of the root surface of the embryo at different times

自然层积10个月后（图3-b），靠近种皮外侧的薄壁细胞开始分化形成栅栏细胞，此时的栅栏细胞长度较短，排列松散；12个月后（图3-c），栅栏细胞进一步发育，显著纵向伸长，排列紧密，基本形成栅栏层。栅栏细胞的细胞壁强烈增厚并木质化，增强了种皮的厚度和硬度，并成为水分进入种子的主要屏障，长达一年的自然层积并没有解除短丝木犀种壳的机械障碍和透性问题。自然层积16个月后（图3-e），内侧薄壁细胞明显分化为漏斗细胞，种皮形成由外到内依次为角质层、栅栏细胞层、薄壁细胞层的明显3层结构，栅栏细胞层占据种皮的绝大部分；到19个月后（图3-f），种皮内形成大量螺旋状管胞结构，且薄壁细胞分泌出大量胶状物质，细胞结构模糊不清；最终在23个月时厚壁组织降解变薄，种壳出现裂口，通透性增强，逐渐消除机械障碍。

图3　自然层积短丝木犀种子不同时期种皮中间部位及子叶末端的纵切面结构Fig. 3　The longitudinal section structure of the middle part of the seed coat and the end of the cotyledon at different stages

2.1.3种子细胞壁加厚过程

短丝木犀自然层积的过程中种壳逐渐栓质化。从种壳纵切面扫描电镜可以看出，种壳角质层和栅栏组织发生强烈的次生增厚（图4-a），维管束具有单纹孔、多数呈横向排列，且排列致密（图4-b）。在短丝木犀种子成熟的中期（自然层积16个月），外表皮细胞壁加厚，比皮下组织改变的规模要大，在有一定结构序列的种壁上，形成囊泡状突起（图4-c），这些大小不一的“囊泡”似乎是与次生壁增厚形成相关的纤维状物质的储集层。相比于种壁外表皮的明显加厚过程，次生壁的加厚过程就不是那么显眼。图4-d可以出，种壁次生层的活动迹象是在主要细胞壁交界处的球体，箭头所指的区域就是次生层增厚即将发展的地区。

2.2　自然层积短丝木犀种子胚乳透射电镜观察的结果

2.2.1种子胚中部位置胚乳细胞内含物超微结构研究

短丝木犀种子成熟时胚中部位置胚乳细胞的显著特点是细胞内存在液泡和少量近圆形的脂滴。由于胞质脂滴与液泡密切接触，使得脂滴之间散布着大量黑色沙粒状的高电子致密物质（图5-a）。自然层积12个月，胚乳细胞中高尔基体、线粒体、内质网、细胞核等细胞器清晰可见（图5-b），液泡开始降解，高电子致密物质开始聚集形成较大的块状结构。自然层积16个月，细胞核清晰可见（图5-c），大液泡分解为小液泡，脂滴数量增多且更加饱满，线粒体、高尔基体依然存在（图5-d）。自然层积19个月，液泡已完全降解，高电子致密物质已聚积成较大的块状，脂滴体积增加，更加饱满，充满整个细胞，但细胞核依然存在（图5-e），脂滴之间依然散布着大量沙粒状的高电子致密物质，线粒体也开始降解（图5-f）。自然层积23个月，胚乳已发育完全，大量脂滴和高电子致密物质充满了整个细胞（图5-g），细胞核形态模糊，在脂滴之间依然存在很多体积较小而电子密度更高的高电子致密物质（图5-h）。这一期间胚中部胚乳细胞结构变化较大，脂类物质消融，大部分高电子致密物质降解，仍存在部分碎片状的高电子致密物质（见表1）。

图4　短丝木犀种壁和次生层加厚过程Fig. 4　Seed wall and secondary layer thickening process

2.2.2种子胚根部位置胚乳细胞内含物超微结构研究

图5　短丝木犀种子自然层积过程胚中部胚乳细胞内含物变化Fig. 5　Changes on ultrastructure of the middle endsperm ofOsmanthus serrulatusduring natural stratification

表 1　短丝木犀种子胚中部位置胚乳细胞内含物变化†Table 1　Variation of endosperm cell contents in the middle position of the embryo ofOsmanthus serrulatus

短丝木犀种子自然成熟时胚根部胚乳细胞的显著特点是含有大量高电子致密物质和脂滴，其形状大小不一，高电子致密物质体积比脂滴大，但没有中部的体积大。胚根部胚乳细胞内壁高电子致密物质较多而且体积较大，脂滴排列较致密（图6-b）。在近胚根处的胚乳细胞中（图6-c），细胞核位于细胞边缘，核仁消失（图6-d）。自然层积12个月的种子，细胞器逐渐消失，近胚根处的胚乳细胞中，液泡、内质网等细胞器均已观察不到（图6-e）。自然层积16个月的种子（图6-f），细胞核被挤压缩小变形。脂滴逐渐由半透明状态转变为透明状态，且有一些脂滴开始溶解。高电子致密物质不断积聚，体积增大。自然层积19个月的种子（图6-g），细胞核已经挤压缩小呈不规则的楔形或星形。脂滴都变为透明状态，且不断消融。脂蛋白进一步增多，高电子致密物质进一步积累。自然层积23个月的种子（图6-h），细胞核变得更小，呈不规则楔形（见表2）。

图6　短丝木犀种子自然层积过程胚根部胚乳细胞内含物变化Fig. 6　Changes on ultrastructure of the endsperm cap ofOsmanthus serrulatusduring natural stratification

表 2　短丝木犀种子胚根部位置胚乳细胞内含物变化Table 2　Change radicel position endosperm cell contents

3　结论与讨论

通过对短丝木犀种子种皮结构的扫描电镜观察和对胚乳结构的透射电镜观察，发现在短丝木犀种子成熟过程中，薄壁细胞逐渐木质化和栓质化，分化形成栅栏细胞，栅栏层不断增厚，种皮由数层薄壁细胞组成转变为由角质层、栅栏细胞层、薄壁细胞层三层结构组成。种子生理休眠的一个主要因素是角质层和栅栏层的机械阻碍，导致吸水困难，延迟代谢活动[19]，由于其角质层和栅栏层增加了种皮的厚度，导致短丝木犀种皮的厚度对种子萌发时突破种皮形成了阻碍。

耿文娟等[20]对野生欧洲李种子萌发特性研究发现了栅栏层细胞结构的变化引起了种皮不透性。憨宏艳等[21]对水青树种子萌发过程中也发现随着种子成熟与种皮的硬实度呈现正相关，种皮的增厚与栅栏层细胞收缩有关。随着短丝木犀种子发育成熟，种皮表面和内部的蜡质不断积累。蜡质通过细胞壁全透性转移到细胞外表面，沉积形成白色蜡被层。蜡层为种子抵御外界不良环境发挥了重要作用，但同时也阻碍种子自身与外界环境的物质交换，比如水、空气，造成短丝木犀种子萌发的障碍。而随着短丝木犀种皮内部蜡质的不断增加，逐渐板结形成不规则的蜡块，也阻碍水分和空气的进入。

王家源等[22]通过对青钱柳种子的研究发现胚乳内脂类物质的迅速增加可能与其种子萌发困难有关，种子的休眠只有在高电子致密物质和脂滴彻底降解后才能被打破；贾书果[23]对秤锤树种子的研究也得出了相同结论。可见，在短丝木犀种子发育过程中，胚乳内含物由小分子物质逐渐向大分子物质转化并积累，为种子营养物质的贮藏提供保障，是种子成熟的重要生理生化过程。

短丝木犀种子发育成熟过程中，胚乳内含物也在不断变化，其中细胞核随着角质层的加厚而被逐渐挤压缩小，由前期的椭圆形逐渐变为后期的不规则楔形，而细胞器则逐渐随着自身成熟而溶解消失，由脂蛋白组成的高电子致密物质不断增多、增大，因此，随着种子的发育，脂蛋白含量升高，脂滴不断增加，在高电子致密物质周围紧密排列，且由半透明状态转变为透明状态，到种子发育后期，脂滴和高电子致密物质充满整个细胞。

胚乳中含有的大量脂滴和高电子致密物质可能对胚生长发育造成一定的机械障碍。在自然层积过程中，短丝木犀种子胚中部位置的高电子致密物质体积明显大于胚根部，而胚根部的高电子致密物质和脂滴的降解速率比胚中部快。当短丝木犀种子层积23个月种胚突破胚乳时，种胚中部中仍含有大量的脂滴和高电子致密物质，而胚根部的高电子致密物质和脂滴降解比较彻底。

短丝木犀种子在自然生境中隔年萌发，存在生理后熟现象，这给短丝木犀的繁育造成了很大困难[24]。为了揭示短丝木犀种子休眠机制，有效解除休眠促进萌发，本研究通过观察种子发育过程中种皮结构变化和胚乳内含物变化，对短丝木犀种子休眠的形成原因进行了分析。本实验得出导致种子休眠的三个因素：第一，短丝木犀种子种皮内外均含有蜡质，对种皮透水性产生阻碍；第二，种子发育过程中，种皮形成角质层、栅栏层和薄壁细胞层三层结构，角质层和栅栏层结构增强种皮硬度，给萌发时突破种皮造成障碍，并且阻碍水分进入；第三，胚乳内脂类物质积聚，代谢活动降低，这些因素都推动了种子休眠的形成。种子休眠是个十分复杂的生理过程，外部环境及种子内部水分、酶活性、生长激素、内源抑制物等各方面因素都会对种子休眠造成或直接或间接的影响[25-26]。因此，要充分了解短丝木犀种子休眠产生的原因，还需要更深入更精细的研究。