柳树种质资源创新与杂交利用研究

乔玉玲，秦光华，宋玉民，康　智，于振旭

（1.山东省林业科学研究院，山东 济南 250014；2. 山东省林木遗传改良重点实验室，山东 济南 250014；3.山东农业大学，山东 泰安 271018）

柳树Salix babylonica是我国重要的阔叶乡土树种之一，广泛应用于防护林、水土保持林、风景园林及用材林，具有较高的经济价值和生态价值。在生态条件复杂的柳树天然分布区内，具有十分丰富的生态和遗传多样性。植物蕴藏着品种改良的重要基因，是育种家用来选育新品种的重要材料，世界各国都非常重视植物种质资源收集、保存、评价与创新利用研究。特别是欧洲各国很重视对植物种质资源的收集与保存，英国皇家植物园收集5万种植物，是世界植物研究中心之一，并建立了世界上最大的柳树种质资源圃[1]。我国开展柳树研究较早的是江苏省林业科学研究院，从60年代初开始收集国内外的柳树种质资源，保存了800余个柳树种质资源，包涵了世界上具有经济价值的柳树主要种类，从而极大地丰富了我国的柳树种质资源[2]。从 2013年开始，我们在海兴农场共种植了国内外柳树优良无性系300多个，成为柳树新品研发基地。

山东柳树栽培历史长，柳树种质资源分布广而且丰富，所处地理生态环境复杂多样，种内群体内部、个体间遗传变异十分丰富[3]。该地区年龄较大的柳树是长期自然选择和人工选择的结果，具有耐涝、抗旱、抗寒、抗风沙、抗虫等优良特性，是重要的遗传资源。但是由于人畜破坏和保护不力，加上不少树木树龄太大，有的已心腐甚至濒临死亡。而快速缓解目前柳树种质资源匿乏的有效方法是柳树资源创新，所以运用现代科学技术对优良基因资源进行系统收集、保存、复制、选育和开发利用研究，创造新种质，拓宽种质遗传基础，选育丰产、优质、抗性强优良类型或单株，对于保存柳树优良基因资源、丰富林木育种群体、保持基因的多样性及加快良种培育、满足林业生产需求具有重要意义。

1　柳树种质资源创新的路径

随着我国经济的发展，植物栽培和技术的改进，现代林木育种对所要改良的目标性状也在不断变化，除要求优质、高产、高效、高抗等特性以外，又提出一些新的目标特点。而育种工作的基础是具有丰富的种质资源，所以进行种质资源的更新换代是大势所趋。柳树种质资源材料的创新可通过3种途径即常规育种、生物技术、辐射诱变来进行品种改良。

1.1　常规育种

常规杂交为主要应用方法，改良品种必须通过杂交育种来进行，技术简单易掌握，也是目前生产上应用最广泛的一种方法。柳树是多用途造林绿化树种，杂交容易、可配性高、易无性繁殖，根据遗传改良的主要目的，来选择有价值的不同性状，可选育出具有不同利用价值的柳树优良品种和无性系。根据柳树的生物学特性，开展人工控制授粉，并通过估测亲本育种值，建立经过遗传改良的新育种群体，再用此新的育种群体进行人工控制授粉，使产生的基因重组，在特定组合中具有优良基因的亲本，可以显著提高杂交育种的遗传增益[2]。通过对杂种Fl代的优良基因型选择，得到多种性状集中表现的优良个体，再通过无性繁殖扩大优良个体的数量，经苗期和造林对比试验测定分析，筛选出速生、高产、优质的优良无性系，应用于大面积的生产造林。美国、英国等许多国家都在进行柳树遗传改良的研究，他们主要在提高林木生物量和环境保护方面进行了研究[4]。我国对柳树进行遗传改良的研究，主要是在工业用材林和各种功能林等方面。涂忠虞等[5]利用垂柳天然实生苗、垂柳×旱柳进行人工杂交，选育出两个具有较大弯曲强度和冲击韧性的优良单株，是很好的矿柱用材。王宝松等[3]利用不同产地的柳树进行种间和属间杂交，历时12 a选出两个优良无性系，可以用于营建柳树矿柱用材林。涂忠虞等[6]以提高生物产量、改良林木干形作为选育的主要目标，进行了种间、种内的不同种源间、属间的远源人工杂交和回交等，最终选育出4个乔木柳无性系，具有生长速度快、干形好的优良特性，适于营造纸浆用材林。涂忠虞等[7]利用垂柳和白柳进行人工杂种，选育出4个金丝垂柳雄株优良无性系，具有鲜亮的枝条颜色、下垂的枝条和花絮大小等观赏性状，同时解决了柳絮对环境的污染困扰。潘建明等[8]利用国内外收集的生长快、干形优的柳树亲本材料，进行柳树种间、种内以及柳属间的远源人工杂交和回交，筛选出8个耐水湿优良无性系。张建秋等[9]利用在我国各地收集23个优良柳树品种，进行了人工杂交，经过10 a的观察测定，最后选出速生、耐寒、耐盐碱的3个柳树新品种。张继明等[10]利用旱柳等经过多次的柳树杂交，田间对比试验，最后选出具有速生、抗寒、抗旱等特性的优良无性系。乔木柳具有早期速生、轮伐期短的特点，在低洼湿滩地上营造的优良无性系人工林，结构均匀，且群体生物量高于杨树，适于营建品质优良的纸浆材林。

1.2　现代生物技术育种

由基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程4方面组成。植物组织与细胞培养技术（细胞工程）、重组DNA技术（基因工程）构成了植物生物技术的主体[11]。在林业生物技术育种中，对现有的遗传资源采用组织培养技术、体细胞胚胎发生和原生质体培养植株再生技术，加以利用快速繁殖技术等，都是属于最基本的。而在这些基本技术的基础上，将外源目的基因导入林木细胞，这种遗传转化技术，创造了新的遗传变异和丰富的育种资源，使林木育种真正达到生物育种技术的水平。利用现代生物技术育种培育的新品种，必须具有遗传多样性、生态多样性和可持续发展的特性，能够适应各种自然环境。所以，常规育种技术是现代生物技术育种的基础，现代生物技术育种须与常规育种技术相互结合，才能培育出理想的优良品种[12]。

1.3　辐射诱变育种

采用电离射线照射生物引起生物遗传物质的变异，再通过目的选择和培育，最终创造出优良新品种。运用这种技术可以极大地加速生物人工进化的进程，增加了生物的变异类型，也为育种工作提供更多的选择方法。采用分子标记和基因工程技术的分子育种，可以辅助常规方法，既可以提高育种效率，又能创造出常规方法难以实现的新种质，为选育出优良品种提供更多的有效途径。人工诱变分为物理诱变和化学诱变，物理诱变剂主要包括射线、中子和激光等，由于射线具有较强的穿透力，能激活原子内层的电子，并使其离子化，与其他的原子或者分子相结合，改变原子结合的方式，所以是利用最多的一种。目前使用效果最好和最广的化学诱变剂主要是EMS、秋水仙素等，其诱导的突变大多是点突变[13]。

2　人工杂交育种

本项目自2013年以来，进行了速生用材柳树育种研究，主要是以全省选出的旱柳优良无性系为研究材料，从2014年开始利用这些材料进行室内切枝人工控制授粉杂交育种试验研究，判断各无性系的有性生殖能力，筛选杂交亲本；从人工杂种中选出遗传变异大、杂种优势明显的杂种，以期选育出具有生长快、干形优良等特点的乔木柳无性系。

2.1　材料和方法

2.1.1试验材料

所选的杂交亲本都是经过选优的优良单株，而且生长健壮、无病虫害[14]。全省采集到24个亲本花枝，其中雄花枝13个，雌花枝11个。

2.1.2杂交组合设计

由于一些花枝在水培时产粉量少或花絮出现萎蔫，所以只进行9个母本、8个父本的26个杂交组合（见表1）。

表 1　柳树26个杂交组合Table 1　The 26 combinations of the willows

2.1.3杂交方法

（1）花枝的采集

2月初于优良母树树冠中上部，选取粗1.5～2.0 cm带有花芽的枝条，去掉徒长枝，截取长1～1.5 m，顶部保留2～3个叶芽。雌花枝应选留中上部发育好的饱满花芽，所留花芽应均匀分布在枝条上；为多收集花粉，雄花枝应保留全部花芽。并在花枝上悬挂标签注明。

（2）花粉的收集及活力测定

待雄花序花药开裂，花粉散出时，将干净白纸放在花序下方，用工具轻轻敲动花序，使花粉散落到白纸上，然后去除花粉中的杂物。每天9:00—11:00、14:00—16:00收集2～3次。收集的干净花粉，用纸袋包好后外加干燥剂（变色硅胶控制湿度）和塑料袋，贴上标签，注明植物品种名称、采集时间、地点等，然后放入0～5 ℃或0 ℃以下的冰箱中低温保存。

授粉前需要对所采花粉进行活力测定。对于低温保存的花粉，需先取出少量要测试的花粉，放入湿度大于80%的环境中吸湿 24 h。将3种MS培养基用玻棒蘸少许，分别滴在载玻片上。用解剖针取少量花粉，分别均匀洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放在铺有2层湿润试纸的培养皿中，置入25 ℃左右的恒温箱中培养，一定时间后取出，在尼康50I高倍光学显微镜下观察花粉的发芽情况，每个处理观察5个视野，并统计花粉萌发率。花粉萌发率=(萌发花粉数/总花粉数)×100%。

（3）人工控制授粉技术

于授粉前1天，将花粉从冰箱中取出，放在阴暗、湿度超过80%的环境中吸潮24 h左右。当雌花开放，于10:00—16:00，花心柱头上有分泌粘液时即为最佳授粉期。对于花粉量大的，可以用毛笔粘取少量花粉，轻抖动洒落在柱头上；花粉量少的，可用带橡皮头的铅笔，将橡皮头削尖后粘取少量花粉，轻点花心柱头，每天授粉1次，连续进行3 d。授粉后及时套袋，并挂上标签。

（4）杂种苗的培育

当果序由绿变黄时，及时套上纸袋，果实成熟后取出纸袋中的种子，当天采摘的随即播种，若采摘种子太少，可以分批存放在冰箱里，2天内播种。

对产种量较少的杂交组合，采用培养皿催芽方式，先在培养皿中放薄薄一层脱脂棉，上盖一张滤纸，用蒸馏水滴湿，然后将种子均匀摆放在滤纸上，将盖好的培养皿置于室内温暖向阳的地方，每天检查种子发芽情况，保持湿润，待培养皿中的种子80%发芽时，即可移栽到营养杯中。

营养杯的基质先用0.3%～0.5%的高锰酸钾浇透进行消毒。移栽时先用工具在营养杯的基质上戳个小洞，然后用镊子轻轻夹取培养皿中发芽的种子，迅速放入洞中并轻轻压实，最后喷水浇透。以后保持室内温度18～28 ℃，湿度50%～70%。苗期正常管理，同时每个星期喷洒0.1% ～0.2%高锰酸钾溶液防治病害。当杂种苗生长到10 cm左右时，即可移入大棚进行炼苗。

2.2　结果与分析

2.2.1培养基的筛选及花粉活力的差异

本实验对3个旱柳优树花粉在3种不同的培养基上进行萌发测定（见表2）。结果表明，旱柳优树花粉在固体（10 g/L的琼脂、150 g/L的蔗糖）和液体（蒸馏水、150 g/L的蔗糖）基本培养基上均有一定的萌发率，但以改良后的培养基（加入0.2 g/L的硼酸）萌发效果最好，萌发率最高46.8%。3个优树花粉萌发率，商19和商10基本相同，垦1的花粉萌发率稍微低一些，说明商19、商10的花粉活力比垦1的活力强。低温冷藏24 h的花粉萌发率普遍比低温冷藏72 h的高，说明花粉随着储藏时间的延长，花粉活力逐渐降低。

表 2　不同培养基花粉平均萌发率Table 2　The average germination rate of different culture medium pollen　　　%

2.2.2杂交亲和的差异

柳树杂交亲和性较高，已杂交的26个组合中，取得种子的有8个母本，7个父本，共16个组合，培育出杂种苗的有12个组合。其中母本博3的亲和性最好，与6个父本的组合都育有种子；母本利9的亲和性最差，与2个父本的组合都无种子（见表3）。

2.2.3超级苗的早期选择

糜蛋白酶优先水解蛋白质中疏水氨基酸如芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和亮氨酸等羧基所形成的肽键，形成芳香族氨基酸和亮氨酸作为末端的肽。在化妆品中用入，对皮肤有抗炎、清疮和去屑作用，与果酸配合，将有利于换皮，可防止粉刺的生成。

以在苗圃中入选的12个优良杂交组合为选择群体，并分别编号为D1～D12。对杂种F1苗木进行选择，早期选择的指标是：生长量大，主干明显、顶端生长优势强、分枝细、枝角小，抗寒、耐早、抗病虫等。超级苗选择主要采用平均苗高生长量标准差，同时参考形质指标，最终筛选出9个优良杂交组合，超级苗22株，平均选择率为1.74%。9个杂交组合的入选率相差不大，D5号杂交组合入选率最高为2.34%，D1号次之，入选率最小的D4号杂交组合为1.03%（见表4）。初选出的超级苗定植于原种圃观测，同时扩繁成无性系进行苗期测定与筛选。

表 3　各杂交组合亲和情况†Table 3　The different combinations of affinity

表 4　柳树超级苗选择结果Table 4　Results of superior seedling selection from Salix family

2.2.4杂种的遗传变异分析

对9个杂交组合22个超级苗进行无性繁殖，并对各无性系的苗高和地径进行方差分析（见表5），结果表明，各无性系间的苗高和地径差异极显著，而区组间差异不显著。

对差异显著的苗高和地径2个性状进一步采用 DUNCAN 法进行多重对比（见表6 ），苗高分析结果表明D12-2与其余无性系差异明显单独分为一组，D1-2、D5-4、D8-2的差异显著，仅次于D12-2排在第二组，证明D12-2苗高显著优于其余无性系；地径多重对比显示 D1-2和 D7-2分为一组与其余无性系差异显著。

表 5　不同无性系间苗高、地径方差分析Table 5　Analysis of variance of height and basal diameter among different families and replications

表 6　不同无性系间苗高、地径显著性差异Table 6　Multiple comparison of height and basal diameter among different families

3　结论与讨论

（1）在柳树种质资源材料创新的3种路径中，常规杂交为主要应用方法，但常规育种方法育种的年限长、耗时、耗力、耗资等，目标性不强，通过无性系变异选择获得特定变异的种质材料有一定难度，很难从基因水平上来改变生物的本性。所以，要想提高育种效率，创造新种质，需要采用分子育种来辅助常规育种方法，这样才能迅速有效的选育出优良品种。

（2）柳树由于枝条细长，花芽、叶芽小而数量多，所以要尽量疏去较多的叶芽，留2～3个为宜。由于人工杂交种子活力较弱，对环境的温湿度和土壤状况有一定的要求，所以育苗时采用种子催芽、点播芽苗、小苗移植的方法，淘汰了无生活力及生活力极弱的种子，提高杂种的成苗率。

（3）花粉离体萌发培养基是以10 g/L琼脂＋150 g/L蔗糖＋0.2 g/L硼酸的萌发效果最好，萌发率最高46.8%。柳树花粉随着储藏时间的延长，其活力逐渐降低。柳树的花粉生活力与贮藏时间成负相关，低温干燥对花粉贮藏是有利的，这与王源秀等[15]的研究结果是一致的。

（4）本次杂交按照交配设计组合数为26个，9个母本，8个父本，取得种子的有8个母本，7个父本，共16个组合，培育出杂种苗的有12个组合，1 251余株苗。得到组合较多的母本是博3，亲和性最好，与6个父本的组合都育有种子，利9没有得到种子。

（5）林木早期选择是是一种相关选择方法，就是利用苗期的性状对后期生长做出预测。采用标准差和形质指标相结合的方法，选出22株超级苗，入选率为1.74%。茹广欣等[16]根据黑杨无性系苗高和胸径生长优势进行苗期选择，可能获得可靠的效果。早期选择对提高林木的遗传增益具有一定的可靠性[17-19]。柳树在苗期高生长变异较大，也比较直观，因此选择时以苗高为主、地径为辅助选择指标。对9个杂交组合超级苗的生长量进行了遗传变异分析，方差分析结果表明苗高和地径在无性系间都达0.01显著水平，多重对比显示 D12-2明显优于其它无性系。

本试验研究只是根据一年生的苗木取得的结果，以后还需要更深入地研究，利用大树的生长量结合干形、木材材性、抗逆性等指标进行综合评价。