屏边三七种子后熟生理研究Ⅱ. 层积后的种子内源抑制物粗提取及生物活性测定

孙玉琴，杨 莉，陈中坚，王朝梁，韦美丽，黄天卫，施莉屏

(文山学院文山三七研究院，云南 文山 663000)

【研究意义】屏边三七(PanaxstipuleanatusH.T.Tsai et K.M.Feng)是五加科人参属植物，又名野三七、竹节七等，其根具有散瘀定通、疗伤止血、滋补等功效，仅分布于云南东南部(屏边、马关、麻栗坡)及越南北方(老街)的低海拔(1100～1700 m)山谷潮湿林内[1]，贵州水城也有分布，目前屏边三七在野外采集已经比较困难，资源处于严重缺乏的处境，因此被国家列为二级保护植物[2]。通过长期对屏边三七的人工栽培中观察到，它的栽培环境与五加科人参属植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen]类似，并且，作为三七的近缘物种屏边三七在其相同的生长环境下抗病性状表现优异，与三七在同一荫棚内种植的屏边三七极少感病，对三七的地上部分病害表现免疫[3]。在人参属的所有物种中，由于三七没有姊妹种，屏边三七和三七具有次最近的共同祖先，是三七的一种重要近缘种[4]，目前对三七的抗病品种选育起了不可替代的作用，同时对西南地区人参属植物种质资源圃的建立有重要意义。【前人研究进展】种子是种子植物特有的繁殖体，对于植物也是种质资源保存的重要材料。和其他人参属植物一样，屏边三七也具有种子后熟的特性。种子休眠，是植物体延迟萌发时间，以免外界不良环境对植物体造成危害，而慢慢形成的特性[5]，许多研究表明，植物种子中存在萌发抑制物质是导致种子休眠的一个主要因素[6], 种子中的很大一部分发芽抑制物质是一些简单的小分子有机物质，其中有一部分是水溶性的[7]。能从果皮、种皮、种胚中提取出萌发抑制物，是酸性或中性等物质[8]。在种子休眠的过程中，内源抑制物的种类是在不断变化的[9]。至今对屏边三七的研究主要针对化学成分[10]、分类[11]、地理分布[12-13]、生物学特性[14-15]、光和日变化[16]，分子生物学[17-20]、叶型[21]等方面。【本研究的切入点】针对屏边三七种子发芽抑制物的研究，前期做了鲜种内源抑制物质的粗提取及生物活性测定[22]，发现屏边三七种子中确有发芽抑制物质存在，种子中各部位的抑制物活性依次为果肉>胚乳>种皮。但屏边三七种子层积后，内源抑制物变化情况未见报道，为此对层积不同天数的屏边三七种子进行内源抑制物的粗提取及生物活性测定，旨在为屏边三七种子休眠机理的研究奠定基础，也是三七与屏边三七的杂交育种的重要前期工作。【拟解决的关键问题】本实验通过对层积不同天数的屏边三七种子的内源抑制物粗提取及生物活性测定，了解内源抑制物质在屏边三七种子后熟期间的变化趋势，以及对种子休眠的影响程度，为今后打破屏边三七种子休眠特性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来源于文山三七研究院砚山试验场种质资源圃中的多年生屏边三七种子，于2015年7月采集，采集后用湿沙层积备用。

1.2 内源抑制物的粗提取方法

层积后每35 d，采集含100粒种子，分离种皮、胚乳(含胚)，分别称重、磨碎后，装入3个50 mL三角瓶中，加入50 mL甲醇，室温下浸提72 h。用滤纸分离滤液和残渣(残渣置于4 ℃冰箱保存)，滤液用60 ℃水浴挥干甲醇，所得浓缩液加入25 mL石油醚萃取后，分离水相和石油醚相。所得水相加入乙醚萃取，分离水相及乙醚相。所得水相继续用乙酸乙酯萃取，分离水相及乙酸乙酯相。水相利用60 ℃水浴蒸干，除去水，所得干物质加入25 mL甲醇后，用滤纸分离残渣及甲醇相。残渣中加入水，得水相。

1.3 抑制物的生物活性测定

(1)受体材料：选取白菜种子作为受体材料。为云南省昆明市春农种业商贸有限公司的日本金黄58品种。

(2)各取3 mL内源抑制物5种相(石油醚相，乙醚相，乙酸乙酯相，甲醇相及水相)，挥干有机溶剂后加入蒸馏水3 mL，水相直接取3 mL进行抑制活性测定，重复3次，以蒸馏水为对照。

(3)将从上述各处理中获得的组份，放入直径9 cm培养皿中，皿中放一直径7 cm的滤纸，挥干有机溶剂后加入蒸馏水3 mL (水相则直接量取3 mL，不必再加蒸馏水)，每皿放白菜30粒，重复3次，培养皿应倾斜放置，利用地心引力使胚根平直生长，易于测量。在28 ℃恒温箱中培养，24 h观察发芽率，48 h测量胚根长度。

1.4 供试有机溶剂的抑制作用检测

取石油醚、乙醚、乙酸乙酯和甲醇各3 mL，放入培养皿内挥干后加3 mL 蒸馏水进行白菜发芽试验以确定其抑制活性。重复3次，以这4种有机溶剂作为阳性对照，以蒸馏水做为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 屏边三七种子层积处理不同天数对白菜种子发芽的影响

屏边三七种子采收后常规处理要用湿沙储藏，以完成种子后熟。一般储藏时间为5～6 个月，因此，设置屏边三七层积处理的时间为175 d，每35 d取出100粒种子用系统溶剂提取法，分别提取分离的种皮和种胚，用提取液对白菜种子做生物活性测定，白菜种子发芽率结果见表1，阳性对照石油醚组白菜种子发芽率为70.44 %，乙醚组白菜种子发芽率为83.18 %，乙酸乙酯组白菜种子发芽率为75.61 %，甲醇组白菜种子发芽率为72.44 %，阴性对照蒸馏水组白菜种子发芽率为86.67 %。

白菜种子发芽率试验结果表明，屏边三七种子层积35 d后，种皮、种胚提取相对白菜种子发芽抑制强度最大，发芽率最低，随着种子层积时间的增加，发芽率逐渐升高，层积175 d后种子发芽率最高，层积后种皮、种胚各提取相的白菜种子发芽率依次为层积175 d>层积140 d>层积105 d>层积70 d>层积35 d。

随着层积时间的增加，白菜种子的发芽率逐渐增高，说明各提取液对白菜种子的发芽抑制作用随层积时间的增加，抑制作用逐步减弱。种子各部位生物活性测定结果显示，各提取相对白菜种子发芽抑制作用种胚的要大于种皮的，说明发芽抑制物质主要存在于种胚中。屏边三七种子在层积105 d后，种皮、种胚提取相的发芽抑制物质对白菜种子发芽的影响逐渐减弱，发芽率与阳性对照组差别不明显；种子层积到175 d时，发芽抑制作用基本解除，发芽率与阴性对照差别不明显。

2.2 屏边三七种子层积处理不同天数对白菜种子生长的影响

2.2.1 层积试验中白菜种子生物活性测定结果屏边三七种子层积不同天数生物活性测定结果见表2，所用不同溶剂及蒸馏水对白菜种子生长影响的阴性对照和阳性对照结果见表3。

表1 层积不同天数的屏边三七种子的内源抑制物提取液对白菜种子发芽率的影响Table 1 Effect of extract of PSS with different stratification duration on the rate of cabbage seed germination (n=90粒)

2.2.2 层积不同天数后，屏边三七种子各部位不同提取相对白菜胚根、胚芽生长比较 屏边三七种子层积35、70、105、140、175 d后，分别用系统提取法提取种皮中内源抑制物，测定白菜胚根生长情况，由表4可见，随着屏边三七种子层积时间的增加，白菜胚根长度逐渐增加。SPSS软件分析显示，层积140和175 d的胚根长度与层积35、70、105 d的胚根长度之间达显著性差异；层积140和175 d 两者及层积35、70和105 d三者之间的差异均不大。同一种有机溶剂提取液提取层积不同天数处理的屏边三七种皮，对白菜种子胚根生长的抑制强度依次为层积175 d<层积140 d<层积105 d<层积70 d<层积35 d。

表2 屏边三七种子层积不同天数对白菜胚根、胚芽生长的影响Table 2 Effect of extract of PSS with different stratification duration on development of radicle and germ of cabbage seed

表3 不同溶剂对白菜胚根、胚芽生长的影响Table 3 Effect of extracts with different solvents on development of cabbage seed

表4 屏边三七种子层积不同天数种皮不同提取相对白菜胚根生长的影响Table 4 Effect of P. stipulenatus seed coat extract with different stratification duration on radicle development of cabbage seed

注：采用LSD法进行显著性分析，同一行不同小写字母为5 %差异显著，下同。
Notes：LSD methods was used to analyze the significance, the different letters in the same line meant 5 % significant difference, the same as below.

表5 屏边三七种子层积不同天数种胚不同提取相对白菜胚根生长的影响Table 5 Effect of PSS embryo extract with different stratification duration on radicle development of cabbage seed

屏边三七种子层积35、70、105、140、175 d后，分别用系统提取法提取种胚中内源抑制物，测定白菜胚根生长情况，由表5可见，随着屏边种子层积时间的增加，白菜胚根长度呈现逐渐增加的趋势。SPSS软件分析显示，除乙醚提取相外，层积140 d的胚根长度与层积175 d 的胚根长度达显著性差异；层积140和175 d的胚根长度与层积35、70、105 d的胚根长度之间达显著差异；同一种有机溶剂提取液提取屏边三七种胚，除140和175 d乙醚提取相外，层积不同天数的处理间都表现出显著性差异。层积不同天数的屏边三七种胚，使用同一种有机溶剂提取液提取的发芽抑制物对白菜种子胚根生长的抑制强度依次为层积175 d<层积140 d<层积105 d<层积70 d<层积35 d。

屏边三七种子层积35、70、105、140、175 d后，分别用系统提取法提取种皮中内源抑制物，测定白菜胚芽生长情况，由表6可见，随着屏边三七种子层积时间的增加，白菜胚芽长度逐渐增加，SPSS软件分析结果表明，层积140和175 d的胚根长度与层积35 d的胚根长度之间达显著性差异；种皮水相对白菜胚芽生长测定结果显示，层积不同天数的处理间都表现出显著性差异，其它4种有机溶剂提取相对白菜胚芽生长测定结果显示，层积不同天数的处理间不完全表现出显著性差异。层积不同天数的屏边三七种皮，使用同一种有机溶剂提取液提取的发芽抑制物对白菜种子胚芽生长的抑制强度依次为层积175 d<层积140 d<层积105 d<层积70 d<层积35 d。

表6 屏边三七种子层积不同天数种皮不同提取相对白菜胚芽生长的影响Table 6 Effect of PSS coat extract with different stratification duration on germ development of cabbage seed

表7 屏边三七种子层积不同天数种胚不同提取相对白菜胚芽生长的影响Table 7 Effect of PSS embryo extract with different stratification duration on germ development of cabbage seed

屏边三七种子层积35、70、105、140、175 d后，分别用系统提取法提取种胚中内源抑制物，测定白菜胚芽生长情况，由表7可见，随着屏边三七种子层积时间的增加，白菜胚芽长度逐渐增加，SPSS软件分析显示，层积175 d的胚芽长度与层积35、70、105 d的胚芽长度之间以及层积140 d的胚芽长度与层积35 d的胚芽长度之间均达显著差异；测定种胚乙醚相和种胚水相对白菜胚芽生长，层积不同天数的处理间都表现出显著性差异，其它3种有机溶剂提取相对白菜胚芽生长，层积不同天数的处理间不完全表现出显著性差异。层积不同天数的屏边三七种胚，使用同一种有机溶剂提取液提取的发芽抑制物对白菜种子胚芽生长的抑制强度依次为层积175 d<层积140 d<层积105 d<层积70 d<层积35 d。

3 讨 论

(1)屏边三七种子层积175 d后，发芽抑制作用基本解除，这与陈中坚对于屏边三七种子休眠研究中——屏边三七种子的休眠期长达165～180 d，在种子离开母体后，种胚还在不断生长，直至成熟[2]的结论一致。层积后屏边三七种子内源抑制物质不断减弱，层积不同天数后屏边三七种子中内源抑制物对白菜种子发芽及生长的抑制作用逐渐下降，与此同时，屏边三七种子的胚芽也在生长过程中，抑制物质主要集中在种胚中，可以提示屏边三七种子形态后熟的原因与内源抑制物相关，内源抑制物种类随着层积时间是否会发生变化，有待进一步研究。

(2)对新鲜屏边三七种子内源抑制物质的粗提取及生物活性测定结果表明，屏边三七种子中所含的内源抑制物主要集中在果肉及胚乳中(另文报道)，种子经过层积后，果肉已经不存在，种胚(含胚乳)内源抑制物质活性要明显高于种皮，说明胚乳中抑制物质的存在，可能是胚形态较小、胚率值极小、种子休眠的主要原因。关于种子不同部位所含抑制物质在活性上的差异，是因为所含抑制物质多少不同，还是因为所含抑制物质种类或性质不同，有待于进一步研究。

4 结 论

层积试验对白菜种子的生物活性测定结果表明，随着种子层积时间的增加，白菜种子的发芽率逐渐增高，且胚根、胚芽的长度均有所增长，说明屏边三七种子随着层积时间的增加，种子中的内源抑制物质在减少，抑制白菜种子发芽的作用减弱；屏边三七种子各提取相对白菜种子萌发的生物活性测定中，种皮各提取相测定白菜种子胚根、胚芽的长度均大于种胚各提取相测定的白菜种子胚根、胚芽的长度，说明种胚各提取相对白菜种子生长的抑制作用大于种皮各提取相，这也表明层积过程中屏边三七种子的发芽抑制物主要集中在种胚中；屏边三七种子层积到175 d时，发芽抑制作用基本解除，此时屏边三七种子后熟过程已经完成，休眠已经完全被打破。