网室内外紫花苜蓿开花散粉及不同近交方式结实性的研究

王月异，王玉祥，金西子，张 博

(新疆农业大学草业与环境科学学院/新疆西部干旱荒漠区草地资源与生态实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

【研究意义】紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作为一种优质的多年生牧草，广泛分布于世界各地，并且在我国畜牧业的发展中扮演着重要角色[1]。牧草种子是牧草生产的基础，并且在整个农业生产中有十分重要的作用。【前人研究进展】早在20世纪80年代刘淑明就在内蒙古锡林浩特对多种苜蓿的开花习性进行了研究[2]；耿华珠、吴永敷等对苜蓿的花部形态、开花习性和传粉受精过程进行了研究[3]；而杨惠文在关中和陕北地区对苜蓿开花习性进行观察后发现单株分枝数和花序小花数是决定单株小花数的主要影响因素[4]。【本研究切入点】现在仅对紫花苜蓿开花习性和传粉对种子产量的影响做了较多研究，而对于紫花苜蓿开花散粉的过程和授粉方式对结实的影响研究的较少。但在不同环境条件下苜蓿的开花习性与结实特性有较大差异[5]，而有关网室隔离条件下的苜蓿开花散粉及不同自交方式下的结实性尚未见报道。【拟解决的关键问题】本文在新疆干旱区绿洲田间试验环境下，从开花动态、散粉特性、花粉活力、柱头可授性，以及不同近交方式的结实性等角度对紫花苜蓿的开花和性器官的成熟过程与种子结实性之间进行研究，以期为人工自交纯合品系选育、杂交和育种提供理论依据和科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地设在新疆乌鲁木齐市三坪农场试验站，地处43°56′N，87°35′E，属中温带大陆性半干旱气候，光照资源丰富，7月平均气温为24.5 ℃，年降水量为180 mL，年平均蒸发量为1780 mL，年平均日照时数2900 h，年平均大于10 ℃的积温3500 ℃，无霜期为170～180 d[6]。

1.2 试验材料

试验材料为2016年秋播的新牧4号紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv. Xinmu No.4)。

1.3 试验方法

1.3.1 网室内、外开花散粉及环境条件的观测 不同环境下气象条件的测定：网室外通过查阅新疆乌鲁木齐三坪实习基地气象监测站5-7月份的温度和湿度；网室内通过数字温湿度仪测定5-7月份的温度和湿度；并在盛花期对网室内外温度和湿度进行连续3 d的测定，每天从8：00-20：00时，每2 h测1次，然后统计各时刻的平均值，所使用的仪器为摄氏温度计和干湿球温度计。

开花及散粉过程观测：在紫花苜蓿现蕾期建立网室，网室大小为长4 m×宽3 m×高2 m，孔径为1.2 mm。在盛花期对网室内、外进行定株观察，首先各随机选取10株健康的植株，并在选定好的植株上随机选取10个花序，在各花序上选取5朵发育状态一致的单花；从第1朵单花开放直至最后一朵单花萎蔫，每隔0.5 h进行1次观察记录。在观测期间，对花序开放的持续时间、单花开始和停止开放的时间、单花开放的持续时间和单花花蕾发育状态进行拍照和记录。

花粉活力采用TTC法测定[7]，柱头可授性采用联苯胺-过氧化氢法测定[8]。

1.3.2 网室内不同近交方式结实性的测定 网室大小同上，盛花期在网室内、外，首先随机选取健壮的植株10株，然后在选好植株中随机选取20个花序，每个花序保留未散粉且发育一致的单花3～5朵进行标记，摘除已开放和不成熟的单花。网室内进行自然授粉和人工授粉，人工授粉包括品种内同株同花，同株异花、异株异花3种近亲交配方式；网室外只进行自然授粉。将授粉后的花序系上标签，标签上注明授粉日期和授粉方式；每个处理完成后将用75 %的酒精对所用工具进行消毒。待荚果成熟后采收结荚，进行拷种，统计结荚率、种子千粒重、单荚种子数和单荚螺旋数。

1.4 数据处理

数据采用Excel 2010进行图表制作和SPSS 20.0统计分析，图像编辑采用Photoshop 8.0进行处理。

2 结果与分析

2.1 网室内、外环境因子及开花散粉的观测

2.1.1 环境因子 通过对新疆干旱区绿洲田间三坪试验地5、6、7月上、中、下旬的平均温度、相对湿度的气候条件的对比(图1～2)，网室外5月上旬至7月下旬的温度均高于网室内，其中5月的平均气温已达到22.6 ℃；在5月进入初花期时，网室外的相对湿度明显低于网室内。在盛花期6月11-13日对网室内、外环境因子进行连续测定后(表1)，发现网室内平均气温低于网室外(5.35±0.02)℃，相对湿度高于网室外2.48 %±0.56 %。

图1 网室内外花期旬平均气温Fig.1 The average temperature per ten days at florescence between net room and out of net room

2.1.2 开花动态观测 对网室内、外紫花苜蓿进行观测后发现花序开放顺序均为自下而上，网室内的紫花苜蓿在5月22日进入初花期，6月7日进入盛花期，6月29日进入末花期；而网室外在5月20日进入初花期，6月5日进入盛花期，6月23日进入末花期。

通过对紫花苜蓿盛花期单花开花动态的观测结果表明，网室内在早上9:00时开始有单花开放，12:00-16:00时达到开花高峰，20:00时左右停止开放；开放后单花可持续2～5 d,在此期间因网室内无具有弹花行为的昆虫，龙骨瓣一直保持闭合，单花寿命较长；网室外每花序开放时间为1～3 d，单花在8:30左右开放，12:00-15:30达到开花高峰，20:00左右停止开放，但开放后单花只持续2～6 h，在此期间大部分具有访花行为的昆虫会有助于龙骨瓣弹开，并且小花在弹花后1～2 h发生萎蔫、闭合。

图2 网室内外花期旬平均相对湿度Fig.2 The average humidity per ten days at florescence between net room and out of net room

在对整个花期紫花苜蓿开放动态(表2)的观测中发现，网室内与网室外在单花开放时间、单花开放的起止时间、开花高峰期和开放后持续的时间上都不同。网室外单花的开放速度明显比网室内快,并且单花寿命较短，当网室外已经出现荚果成熟的情况时，网室内仍为一片花朵盛开的景象。

表1 盛花期一天中不同时间相关环境因子对照Table 1 The contrast of environment factor in different time during a day at florescence

表2 紫花苜蓿网室内、外单花开放动态分析Table 2 Single flower open dynamic of alfalfa in and out of net room

2.1.3 单花散粉特性 通过对网室内、外紫花苜蓿单花开放动态的观测，发现网室内、外环境的变化对单花发育并无明显影响，因此可以把紫花苜蓿的开花过程划分为六个时期，即Ⅰ.旗瓣露白；Ⅱ.旗瓣伸出花萼；Ⅲ.旗瓣完全伸出花萼；Ⅳ.旗瓣完全伸出花萼翼瓣未展开；Ⅴ.旗瓣完全伸出花萼翼瓣展开；Ⅵ.旗瓣翻转。其中，在Ⅰ时期，旗瓣未伸出花萼，此时花药呈淡黄色，且形态饱满；在Ⅱ时期，旗瓣稍露出花萼，此时花药呈黄色，并且无花粉散出；在Ⅲ时期，旗瓣长度伸出花萼时，花药颜色变暗，但未散粉，柱头上也无花粉黏着；在Ⅳ时期，旗瓣完全伸出但未展开，此时雄蕊已成熟并开始散粉，但柱头未开裂；在Ⅴ时期，旗瓣、翼瓣已完全伸出，但翼瓣未展开，此时柱头已开裂，并有花粉附着；在Ⅵ时期，旗瓣、翼瓣和龙骨瓣已完全展开，并且龙骨瓣已向上翻转，有大量花粉散出，且部分花粉粘在柱头上(图3)。因此确定紫花苜蓿雌雄蕊的成熟时间：在Ⅳ时期雄蕊开始散粉，在Ⅴ时期雌蕊柱头开裂。

2.1.4 花粉活力 对紫花苜蓿单花发育的6个时期中花粉活力进行测定(图4)，发现网室内、外花粉活力在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ时期具有差异；随着单花的生长发育，网室内、外的花粉活力在Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ时期并无差异。当紫花苜蓿发育到Ⅳ时期时，网室内、外花粉活力均达到最大值，分别为96.33 %和93.22 %；此时雄蕊已经开始散粉，之后花粉活力虽然开始下降，但仍保持较高的活力，这与雌雄蕊的散粉时期保持一致。网室内、外花粉活力的大小可能与环境条件的变化有一定关系。

2.1.5 柱头可授性 紫花苜蓿柱头上含的过氧化物酶可以与过氧化氢发生反应释放氧气，因此柱头上气泡的量越多，说明过氧化物酶活性越强，柱头可授性也越强。网室内、外苜蓿单花均在Ⅰ时期，柱头周围没有产生气泡，可授性最弱；随着单花的生长发育，柱头可授性逐渐增强，在Ⅱ时期柱头开始具有可授性，在Ⅲ、Ⅳ时期柱头可授性增强，在Ⅴ和Ⅵ时期柱头可授性最强，这与根据散粉时期对苜蓿花部形态观测的结果一致，说明苜蓿在Ⅴ时期，柱头开裂且发育成熟(表3)。

2.2 不同近交方式结实性

网室内紫花苜蓿异株异花授粉的结荚率为32.14 %±0.01 %a、单荚螺旋数为(3.16±0.10a)个，均于同株同花、同株异花2种近亲交配方式存在着明显差异；异株异花与同株同花中的种子千粒重分别为(2.49±0.02a)、(2.02±0.14b) g，具有明显差异。网室内同株同花、同株异花、异株异花3种近交方式下的单荚种子数分别为(1.70±0.26a)、(3.33±0.85a)、(3.57±0.20a)粒，均差异不显著。网室内人工授粉处理下的紫花苜蓿结荚率、单荚种子数、单荚螺旋数和种子千粒重均高于网室内自然授粉；网室外自然授粉的结荚率为78.63 %±0.01 %a、单荚螺旋数为(4.82±0.08a)个、种子千粒重为(3.21±0.08a)g，均与网室内人工授粉和自然授粉有显著差异；而单荚种子数只与网室内自然授粉有显著差异(表4～5)。

a.旗瓣露白；b.旗瓣伸出花萼；c.旗瓣完全伸出花萼；d.旗瓣完全伸出花萼翼瓣未展开；e.旗瓣完全伸出花萼翼瓣展开；f.旗瓣翻转；a1～f1表示各时期对应雌雄蕊状态a.The vexillum white; b.The vexillum out of the calyx; c.The vexillum is completely out of the calyx; d.The vexillum is fully extended and the calyx but wing is not unfolded; e.The vexillum is fully extended out of the calyx flap and wing is unfolded; f.The keel flipping; a1-f1 that the corresponding period of female and stamen图3 紫花苜蓿雌雄蕊发育过程与花部形态Fig.3 The developmental process of the male and female and the flower morphology of alfalfa

Ⅰ.旗瓣露白；Ⅱ.旗瓣伸出花萼；Ⅲ.旗瓣完全伸出花萼；Ⅳ.旗瓣完全伸出花萼翼瓣未展开；Ⅴ.旗瓣完全伸出花萼翼瓣展开；Ⅵ.旗瓣翻转；图中不同字母表示差异显著(P<0.05)Ⅰ.The vexillum white; Ⅱ.The vexillum out of the calyx; Ⅲ.The vexillum is completely out of the calyx; Ⅳ.The vexillum is fully extended and the calyx but wing is not unfolded;Ⅴ.The vexillum is fully extended out of the calyx flap and wing is unfolded; Ⅵ.The keel flipping; The different letters in the diagram show significant differences(P<0.05)图4 紫花苜蓿网室内外花粉活力动态变化曲线Fig.4 Dynamic curves of pollen viability in alfalfa between net room and out of net room

3 讨 论

3.1 温度和湿度对开花散粉的影响

开花习性会因为环境条件的不同有所差异[4]。韩建国、石凤翎等人的研究发现,植物的品种、花序的位置，以及栽培条件都会对单荚种子数产生影响[9-10]。通过对紫花苜蓿花期进行观测，网室内、外的开花动态明显不同，网室内单花开放后持续时间明显长于网室外。单花寿命的长短与环境中温度和湿度有很大的关系。网室外单花在被昆虫弹花授粉后，花会在1～2 h内发生萎蔫、闭合；而网室内因隔绝具有弹花行为的昆虫，使得龙骨瓣未被弹开，小花可持续2～5 d不凋谢。网室外干燥的空气和较低的湿度也是影响单花开放时间的原因之一[5,11]。从开花动态与环境中温度和湿度的对比看，环境条件的不同对开花有重要影响，较高的温度和干燥的空气对单花发育有一定影响[5]。

表3紫花苜蓿网室内外不同散粉时期柱头可授性
Table 3 The stigma receptivity in different pollination period of alfalfa in and out of net room

单花发育时期Single flower development period柱头可授性Stigma receptivity网室内Net room网室外Out of net roomⅠ--Ⅱ+-+-Ⅲ++Ⅳ++Ⅴ++++Ⅵ++++

注 : “-”表示柱头周围没有气泡，表示柱头没有可授性或可授性较弱；“+-” 表示柱头四周有少量气泡，表示柱头可授性适中；“+”表示柱头四周有较多气泡，表示柱头可授性较强；“++”表示柱头四周有大量气泡，表示柱头可授性强。
Note: ‘-’ indicates that there is no air bubbles around the stigma, indicating that the stigma is not grantable or less; ‘+-’indicates that there is a slight bubble around the stigma, indicating that the stigma is; ‘+’indicates that there is more bubble around the stigma, indicating that the stigma is highly; ‘++’ indicates that there are a lot of bubbles around the stigma, indicating that the stigma is more highly.

花的性器官的发生与分化是由植物内在的遗传物质、内源激素及其外在的环境条件共同决定的[12]。网室内、外苜蓿单花发育状况一致，雄蕊比雌蕊成熟的早，这与张爱勤等研究结果基本相同，雌蕊发育晚于雄蕊，并且雄蕊在Ⅳ时期(旗瓣展开而翼瓣未伸出花萼)开始散粉，在Ⅴ时期(龙骨瓣已伸出花萼但未展开)雌蕊柱头开裂[13-14]。说明网室的环境条件对紫花苜蓿的花的发育无明显影响，但花在发育过程中激素的种类和含量变化对植物性别的分化起到了诱导作用[15]，这在今后可以研究如何利用激素来改变植物雌雄蕊分化以及成熟先后顺序，从而更好的为育种提供理论参考和技术支持。

花粉活力受遗传基因和环境因素两方面影响[16]。枣的花粉活力在不同条件下可以维持数月至1年[16]；茄在不同季节花粉活力持续时间的长短也不同，夏季可以存活1 d，冬季可以存活3 d[17]；多枝柽柳的花粉活力在不同的环境条件下可以维持长达48 h[18]。近些年来，国内外在对拟南芥、白菜、高梁、小麦等植物的研究中发现温度的不同会影响花粉发育和基因表达[19-22]，而内源激素对细枝柃的花粉活力和受精结实会有一定影响[23-24]，但在紫花苜蓿中还尚未见报道，今后可以从激素和遗传基因等方面对花粉的生长发育以及活力做进一步研究。但在内源激素与花粉活力和受精结实的影响，以及温度胁迫对花粉发育过程影响等方面研究较少，今后可以在生理调控和基因表达方面进一步研究花粉的发育，以探明花粉在植物生殖过程中的重要意义。

表4 紫花苜蓿网室内不同近交方式下的结实性Table 4 Seed setting of alfalfa under different ways of inbreeding in net room

注：表中不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
Note:The different letters in the table show significant differences(P<0.05).The same as below.

表5 紫花苜蓿网室内外不同授粉方式下的结实性Table 5 Seed setting in different pollination methods of alfalfa in and out of net room

柱头可授性与开花时间有一定关系[25]，紫花苜蓿柱头可授性随花蕾发育的不同时期呈上升的变化趋势。植物的生殖过程与柱头的最佳授粉时期和可授期的长短有密切关系，确定最佳授粉时期可以帮助建立高效的自交或杂交技术。例如，不同品种的烟草在开花前后的柱头可授性强弱不同，选择可授性较高的时期进行授粉可以提高结实率[26]。

3.2 不同近交方式对结实性的影响

在网室隔离条件下，3种近亲交配方式中品种内异株异花结实率最高,同株同花结实率最低，这与王庆飞的研究结果相一致[27]。导致此现象出现的原因可能是紫花苜蓿不同植株上花蕾的花粉和柱头的成熟程度不一致性,能够减少不亲和基因的表达,从而促使花粉顺利萌发生长和有效受精[28]。而网室内人工授粉的结荚率、单荚种子数、单荚螺旋数、种子千粒重比自然授粉的高出1～2.1倍，说明在人工授粉可以提高苜蓿自交结实率[29]。网室内自然授粉的结荚率低于网室外，其原因是网室内是无昆虫弹花授粉，只能进行自花授粉；而网室外在盛花期单花大量开放时，有大量昆虫进行访花并传粉受精，因此结荚率有了大幅度的提高。

4 结 论

在新疆干旱区绿洲田间试验条件下，对网室内、外新牧4号紫花苜蓿的开花动态、花粉活力、柱头可授性、散粉特性，以及不同近交方式结实性等进行研究，旨在揭示开花散粉规律与不同近交方式种子结实之间的关系，为苜蓿育种技术提供依据。网室内进行人工去雄控制授粉，品种内近亲交配的方式分别为同株同花、同株异花、异株异花。结果表明，①新疆干旱区绿洲农田苜蓿花期网室内平均温度低于网室外，相对湿度高于往室外；在盛花期6月11-13日对网室内、外环境因子进行连续测定后，发现网室内平均气温低于网室外(5.35±0.02)℃，相对湿度高于网室外2.48 %±0.56 %。②网室内、外花序开放顺序均为自下而上，网室内苜蓿单花在早上9:00开放，网室外在早上8:30开放，单花开放高峰期网室内是12:00-16:00，网室外是12:00-15:30；单花开放后持续时间网室内为2～5 d,网室外为2～6 h。③网室内、外单花均在Ⅳ时期开始散粉，此时网室内、外的花粉活力分别是96.33 %和93.22 %；在Ⅴ时期雌蕊开裂，此时网室内、外柱头均具有较强的可授性。④品种内异株异花的结荚率为32.14 %±0.01 %、单荚种子数为(3.57±0.20)粒，单荚螺旋数为(3.16±0.10)个、种子千粒重为(2.49±0.02)g，比同株同花、同株异花高出1.5～3倍；网室内自然授粉的结荚率为11.67 %±0.00 %、单荚种子数为(1.63±0.06)粒，单荚螺旋数为(1.42±0.06)个、种子千粒重为(1.67±0.12)g；网室外自然授粉的结荚率为78.63 %±0.01 %a、单荚螺旋数为(4.82±0.08a)个、种子千粒重为(3.21±0.08a)g，均与网室内人工授粉和自然授粉有显著差异；而单荚种子数只与网室内自然授粉有显著差异。综合分析认为，在苜蓿单花发育至Ⅳ时期(旗瓣展开而翼瓣未伸出花萼)雄蕊未散粉时进行授粉的效率较高，可以增加授粉的可信度。在今后苜蓿纯合体系自交选育过程中，自交早世代(自交1～2代)的个体基因型杂合度高，采用同株异花交配较好；自交晚世代(3～5世代)个体基因型杂合度低，采用品种内异株异花交配较好。