肿瘤免疫微环境评价在疗效预测中的研究进展*

肿瘤微环境免疫特征已经被列入肿瘤十大特征之一［1］，其一方面能够在预测患者临床预后中发挥作用；另一方面，还能预测患者临床化疗或者放疗等的临床疗效［2-3］。因此，分析肿瘤微环境中免疫细胞的种类和分布等，具有重要的临床意义。

研究显示［4-7］，肿瘤局部浸润着各种免疫细胞亚群，包括巨噬细胞（macrophage，Mφ）、树突状细胞（dendritic cell，DC）、肥大细胞、自然杀伤细胞（natu⁃ral killer cell，NK）、初始和记忆性CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞，以及不同的效应性CD4+T细胞亚群，如Th（helper T cell）1型细胞、Th2型细胞、Th17细胞和调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）等。然而，由于肿瘤类型的不同，浸润的免疫细胞也不同，甚至同种病理类型的肿瘤、不同的肿瘤患者间，浸润的免疫细胞亚群也具有差异。这些免疫细胞亚群又因在肿瘤微环境中分布的位置不同有所区别。因此，如何建立有效的免疫评价体系，成为目前亟待解决的问题。

1 免疫结构的特征及其临床意义

通过免疫组织化学染色分析肿瘤局部浸润的免疫细胞亚群的数量和位置，可以得到肿瘤微环境的免疫结构特征［8］（表1）。Mφ、肥大细胞、DC和髓源性免疫抑制性细胞（myeloid derived immune suppressor cell，MDSC）分布于肿瘤的中心区和肿瘤周围［9］。NK细胞则主要位于肿瘤基质。未成熟DC主要位于肿瘤中心区，而成熟DC和B细胞多见于次级淋巴组织［10］。研究显示，非小细胞肺癌［11］、结肠癌［12］、黑色素瘤［13］和头颈部肿瘤［14］的中心区和肿瘤浸润边缘均有T细胞分布。其中CD8+T细胞，主要分布在肿瘤浸润边缘。但是在结肠癌中［12］，记忆性T细胞主要聚集在肿瘤中心区，其比例随着肿瘤的增大而降低。

表1 不同免疫细胞亚群的表型和功能特征

此外，免疫细胞群的密度不同，患者预后也不同［15］。高密度的CD3+T细胞、细胞毒性T细胞和记忆性T细胞与疾病无进展生存（progression free survival time，PFS）和总生存（overall survival time，OS）延长显著相关［12］。研究报道，卵巢肿瘤中心区的Treg细胞数量与患者预后呈负相关。然而，一些淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌和头颈部肿瘤的相关研究结果提示，肿瘤局部Tregs细胞的密度与患者的总生存呈负相关。这些结果的差异可能是由于细胞密度的不同造成的，密度较低时会降低免疫细胞的作用效果。

2 免疫评分体系的建立及其临床实践

肿瘤局部复杂的免疫细胞组成通过协同作用或者相反的作用共同影响着肿瘤的发生发展。因此，如何分析肿瘤细胞、免疫细胞和组织微环境这三个系统之间的相互作用在临床中的意义，成为研究者面对的难题。

Pagès等［12］针对29例早期（TNMⅠ期和Ⅱ期）大肠癌组织进行基因芯片分析发现，肿瘤局部浸润的CD45RO+细胞越多，Th1类和CD8+杀伤性T细胞的相关基因表达越强。前期研究显示，无淋巴和远处转移的局限性结肠癌患者，手术治疗后仍有25%复发，因此，亟需一种能够判断患者能否从辅助化疗获益的方法。该研究组采用免疫组织化学染色的方法，在两个队列共计602例早期（TNMⅠ期和Ⅱ期）大肠癌组织中检测了CD8和CD45RO的表达，并将肿瘤分为中心区域（tumor center，CT）和交界区域（invasive margin，IM）。按照CD8和CD45RO的表达密度不同，通过统计学分析计算出临界值，并按照临界值将CD8和CD45RO的表达分为高密度和低密度；若免疫细胞在CT区或IM区为高密度表达，记作1分，低密度表达记作0分，CD8和CD45RO在两种不同分区的表达得分相加为免疫得分。按照这种方式，免疫评分被分为I0～I4共5级，CT区和IM区均为高密度的定义I4，CT区和IM区均为低密度的定义为I0，并分析患者PFS和OS与免疫评分的相关性。使用免疫评分的方法分组后，该团队发现免疫评分较高（I4）的分组5年OS为86.2%，PFS为95.2%；相反，免疫评分较低的分组（I0～I1）中，72%的患者出现复发，5年OS仅27.5%。由此可见，I0～I1的患者能够从辅助化疗中获益。为了进一步验证免疫评分体系的预测效果，该研究组［16］继续扩展研究样本和评价指标，在599例包括临床各期的大肠癌患者（TNMⅠ～Ⅳ期）中分析了免疫评分与患者预后的关系，得到相似的结论，并将纳入免疫评分的免疫细胞亚群扩展为CD3/CD45RO、CD3/CD8或CD8/CD45RO组合［12］。同时，其采用Cox回归进行了多因素分析，结果显示纳入免疫评分评价体系后，因肿瘤的侵袭与免疫反应的强弱显著相关，免疫评分超越TNM分期成为预测患者无疾病生存（diesease free survial，DFS）和OS的更加优越的一套评价系统。

在2012年世界免疫治疗理事会会议上，由肿瘤免疫治疗协会牵头建立了免疫评分特别工作组，以推广上述评价体系的临床应用［17-19］。目前已经有来自17个国家的23个中心，3 855例患者按照免疫评分进行评估，其中通过了质量控制而纳入统计的共2 667例患者，计数的CD3+T细胞数量达3.52×108。结果显示，临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的肿瘤患者，免疫评分越高，无疾病生存时间越长；在临床Ⅱ期的结肠癌患者中，较低的免疫评分（I0～I1）是患者预后不良的高危因素。多因素分析结果提示，除了微卫星不稳定、T分期、N分期、年龄和性别，免疫评分也是评价患者OS和PFS的一项重要影响因素。这些结果基本与前期单中心结果一致，进一步验证了免疫评分的有效性和可重复性。

此外，通过研究结肠癌组织中微卫星不稳定与患者临床特征和预后的关系，发现其与肿瘤突变负荷有关，与肿瘤局部Th1反应、记忆性T细胞增加和免疫评分增加呈正相关；继续进行多因素分析显示，在评价结肠癌患者PFS和OS中，免疫评分优于微卫星不稳定，与肿瘤患者预后的相关性更密切［20］。

近年，免疫评分在肿瘤预后评估中的报道也逐渐扩展到胃癌［21］、恶性黑色素瘤［13］、头颈部肿瘤［14］和肾癌［22］等多种类型的肿瘤研究中。研究认为，免疫评分能够用于所有类型肿瘤的预后评价。Berghoff等［23］评估了脑转移患者CD8+T细胞的密度与临床预后的关系。采用免疫组织化学染色法检测116例脑转移组织中CD3、CD8、CD45RO、Foxp3、程序性死亡受体（programmed death-1，PD-1）及其配体PD-L1，结果显示，99.1%（115/116）的组织有肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）浸润，28.4%（19/67）的组织显示PD-L1阳性，但是PD-L1的表达与TIL的密度无关（P＞0.05）。CD3+、CD8+和CD45RO+细胞密度与中位OS呈正相关。多因素分析结果显示免疫评分是患者预后的独立影响因素（P＜0.001）。

3 免疫图谱与临床预后

随着新型检测技术的应用，质谱流式检测技术和单细胞测序技术逐渐应用到肿瘤免疫特征检测领域，其能够描绘出围绕肿瘤的免疫细胞特征图谱，成为针对肿瘤免疫微环境的新型评价手段［24-26］。Chevr⁃ier等［24］采用质谱流式细胞技术和多色免疫荧光技术相结合的方法，分析了73例肾透明细胞癌和5例健康对照的临床标本，将单核-巨噬细胞分为17个亚群，将T细胞划分为22个亚群，发现了与疾病DFS相关的免疫构成，初步描述了肾透明细胞癌微环境的免疫图谱。

该研究显示，在肾透明细胞癌微环境中，T细胞是主要的免疫细胞群，占微环境细胞比例平均为51%；髓系细胞、NK细胞和B细胞所占比例依次为31%、9%和4%。粒细胞和成熟浆细胞在肿瘤微环境中比例较少。进一步分析显示，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）异质性最大，其次是CD8+T细胞，而CD4+T细胞表型相对一致。该研究进一步证实肿瘤特异性和组织特异性巨噬细胞具有表型多样性特点，鉴定出HLA-DRhighCD68highCD64highCD11b-TAM或HLADRhighCD68highCD64highCD36-TAM仅存在于Ⅱ期及以上肾透明细胞癌中，此外，CD204+CD38+CD163-CD206-CD169-TAM比例与肾透明细胞癌患者PFS呈正相关，而CD204+CD206-CD163-CD169-TAM和CD204+CD163+CD206+CD169+TAM的比例与肾透明细胞癌患者PFS呈负相关。在CD8+T细胞和CD4+T细胞亚群中，PD-1+细胞比例均增高。但是，仅有少量PD-1+CD8+T细胞群同时表达其他免疫抑制因子（如Tim-3、CTLA-4）。根据活化因子（CD38）和共刺激分子（ICOS和4-1BB）表达的差异，PD-1+CD8+T细胞分为不同的亚群，这提示肾癌微环境中CD8+T细胞群异质性较大。与之不同的是，PD-1+CD4+T细胞显示出相似的表型，共表达抑制性分子CD38和Tim-1，低表达ICOS和4-1BB。该研究揭示了影响肾透明细胞癌患者预后的特异性的免疫细胞亚群特征，充分展示了肾癌患者免疫细胞的多样性特点。

Lavin等［25］筛选28例肺腺癌患者外周血、非肿瘤肺组织和肺癌标本，使用质谱流式细胞技术和多因子检测技术进行分析。结果显示，在Ⅰ期肿瘤患者，肿瘤局部已经显示出大量MDSC浸润，NK细胞和CD141+DC细胞减少，而CD1c+DC、PPARγhighMφ、PD-1+T细胞均增多。此外，该研究还鉴定出CD39highCD38highPD-1highCTLA-4highTregs细胞群，同样也显著增多。这些免疫细胞特征构成了早期肺腺癌患者个体化的“免疫特征图谱”，为进一步开展针对早期肺腺癌的特异性免疫疗法提供了思路。

在免疫治疗过程中，有可能因为免疫细胞浸润而产生假性进展，从而影响疗效的评价。近来有学者提出通过绘制动态免疫图谱的方式，监测患者的免疫反应［27］。通过治疗过程中连续取样，绘制动态免疫图谱，有利于识别与治疗有关的动态生物标志物，监测患者的免疫治疗效果，区分假性进展，明确具有潜在反应性的患者，使更多患者获益［28］。

4 肿瘤免疫微环境评价在免疫检查点药物治疗中的应用

免疫治疗为抗肿瘤治疗带来了巨大革新，其中免疫检查点抑制剂的进展最为瞩目。目前临床上应用较多的免疫检查点药物主要是PD-1/PD-L1抑制剂，在晚期黑色素瘤［29］和非小细胞肺癌［30］等多种实体瘤治疗中为患者带来长期生存获益。然而，接受药物治疗的患者，客观有效率仅10%～30%［31］。已知，肿瘤细胞及间质细胞上PD-L1的表达是导致肿瘤浸润免疫细胞失能的主要机制之一，也是与PD-1药物应答相关的主要机制。早期研究通过检测肿瘤细胞PD-L1的表达，显示PD-L1阳性患者的客观缓解率仅36%［32］。该研究进一步分析了肿瘤和机体免疫系统作用的4种形式：1）肿瘤细胞表达PD-L1且周围大量免疫细胞浸润，这种情况是因为免疫细胞分泌的细胞因子IFN-γ等诱导了PD-L1的上调，此时PD-1抗体治疗效果最好；2）无免疫细胞浸润也无PD-L1表达，此时需要采用其他方法增加肿瘤局部免疫细胞浸润；3）肿瘤细胞广泛表达PD-L1，但无免疫细胞浸润，在约1%的黑色素瘤中，PD-L1在肿瘤细胞广泛表达，这是由于癌基因驱动的肿瘤内源性表达；4）肿瘤内有大量免疫细胞浸润，但肿瘤无PD-L1表达，这时肿瘤局部浸润的可能多是免疫抑制细胞。此外，以上情况也可能同时出现，如检测头颈部肿瘤组织显示，PD-L1在肿瘤中广泛低表达，而在肿瘤浸润淋巴细胞中高表达。

近年研究［33］显示多种因素可能影响抗PD-1/PDL1治疗的效果，主要包括：1）针吸活检时由于组织较小检测不到；2）肿瘤组织中PD-L1在不同部位可能表达强度不同，造成检测差异；3）治疗过程中，PD-L1的表达随着治疗进行可能呈现出表达差异；4）PD-L1表现为膜表达和浆表达两种形式，仅膜表达的肿瘤细胞能够与PD-1+T细胞相互作用；5）由于抗体不同，PD-L1特异性和亲和力不同，造成检测结果可能出现差异；6）PD-L1能够在肿瘤微环境中多种类型细胞表达。研究显示，20%的乳腺癌组织中及其与之相邻的肿瘤浸润免疫细胞（包括巨噬细胞和T细胞）高表达PD-L1；在胃肠道等肿瘤组织中PD-L1常表达于免疫细胞而非肿瘤细胞，其中又以巨噬细胞为主。这些PD-L1+免疫细胞的意义尚需要进一步研究。

综上所述，这些原因均给抗PD-1/PD-L1的疗效预测带来了挑战。因此，肿瘤免疫微环境的细致分析，对于更准确地预测免疫治疗的效果至关重要。

5 结语

肿瘤局部微环境免疫细胞的特征，通过精细描绘不同肿瘤患者的免疫细胞定位、亚群和表型特点，能够为患者提供有针对性的免疫疗法，提高免疫检查点疗法的临床疗效，也为进一步开发新型的免疫疗法奠定了基础。相信随着研究的不断深入，肿瘤微环境免疫特征也将进一步丰富和完善，并更好地指导临床实践。

（2018-03-16收稿）

（2018-06-11修回）