新疆昭苏县马感染嗜吞噬细胞无浆体血清学与分子生物学调查

李烛南，卢怡竹，王振国，刘志杰，殷　宏，，曾巧英

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070;2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046；3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009)

无浆体(Anaplasma)属于立克次体目、无浆体科、无浆体属，是一类蜱传播的专性细胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中，其引起的疾病被称为无浆体病。主要的无浆体病原包括边缘无浆体(Anaplasmamarginale)、绵羊无浆体(A.ovis)、中央无浆体(A.centrale)、牛无浆体(A.bovis)、嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytophilum)和扁平无浆体(A.platys)[1-2]。嗜吞噬细胞无浆体是一种人畜共患病病原体。该病原呈全球范围分布，主要通过硬蜱属的蜱传播，感染包括人在内的大部分哺乳动物，是一类重要的动物源性人兽共患蜱传病。2006年安徽芜湖暴发的人群体性不明原因发热的疫情，继发感染病人均为接触嗜吞噬细胞无浆体感染的原发病人血液或体液引起。最终这次疫情被确诊为人粒细胞无浆体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)，该病也被卫生部定为我国新发传染病[3]。

新疆是全国五大牧区之一，同时也是硬蜱种类较多的省份之一，马属动物养殖业是新疆畜牧业发展的重要产业。昭苏县位于伊犁河上游特克斯河流域，是伊犁马等马种的重要牧养区。畜牧业生产方式使牧民和家畜有密切接触的机会,特别是蜱虫孳生季节,散养家畜体表寄生大量硬蜱,加大了蜱传人兽共患病传播给人群的风险。为了调查新疆昭苏地区的马是否存在嗜吞噬细胞无浆体感染情况，我们对当地马匹进行了血清学及病原分子生物学调查分析。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1样品2012年在新疆省昭苏县对100匹马进行了血液样品采集。每匹马分别采集2份样品，1份用于DNA提取，另1份用于血清制备。

1.1.2主要试剂Focus Technilogies HGA IFA IgG Test Kit，美国VMRD公司产品；QIAamp DNA Mini Kit，德国QIAGENQ公司产品；pGEM-T easy Vector，美国Promega公司产品；Gel Extraction Kit，美国Omega Bio-Tek公司产品；JM-109感受态细胞、RNase-free water、EXTaqDNA聚合酶，DNA Marker DL 2 000，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2　方法

1.2.1样本基因组DNA提取按照DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN,Hilden,Germany)操作说明，将采集保存在EDTA-K2中的血液样品吸取300 μL，加入900 μL红细胞裂解液，室温放置15 min后，13 000 r/min离心30 s,弃掉上清液保留沉淀。在沉淀中加300 μL白细胞裂解液，涡旋10 s。再加入100 μL蛋白沉淀试剂，涡旋20 s后，13 000 r/min离心1 min。将上清液转移至新离心管中，加入300 μL的异丙醇颠倒至出现白色絮状物，13 000 r/min离心1 min。弃掉上清液，沉淀中加入300 μL 700 mL/L乙醇，颠倒至沉淀悬浮，13 000 r/min离心1 min。倒去乙醇，静置晒干后加入DNA水合溶剂，封装置-20℃保存。

1.2.2间接荧光免疫(IFA)检测采用间接荧光免疫法(IFA)，检测马血清中IgG抗体。操作按照试剂盒说明书进行，首先将专用载玻片从冰箱中取出，为避免表面有冷凝水，可待玻片至室温后再打开包装。标准阴性、阳性对照样品用PBS按照1∶32稀释后，每孔加25 μL，并设复孔。待测样品用PBS按照1∶64稀释后，每孔加入25 μL，37℃孵育30 min。接着，1×PBS溶液洗涤3次，在纯水中轻轻漂洗后取出晾干。每孔加入25 μL酶标试剂，37℃孵育30 min后重复上述洗涤操作。每孔加入少许缓冲甘油，盖上盖玻片后置于100×荧光显微镜下观察结果。在荧光显微镜下，100倍放大后观察，出现3个以上与阳性对照类似形状的荧光点时，判定为为阳性。

1.2.3PCR扩增将间接荧光免疫法(IFA)检测到的阳性样品相对应的基因组样品用来进行PCR扩增。PCR均在25 μL反应体系中进行，嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因扩增的引物序列见(表1)。第一轮采用EC9/EC12A[3]，扩增条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 10 min。第二轮采用SSAP2f/SSAP2r[3]，扩增条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR反应体系：25 μL反应体系中含2.5 μL 10×PCR缓冲液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，上、下游引物各0.5 μL(20 pmol/μL), 0.125 μL ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL DNA样品，17.375 μL RNase-free water。

表1　PCR引物序列

1.2.4核酸序列测定及系统进化分析用Gel Extraction Kit (OMEGA)试剂盒将PCR产物进行回收，将回收后的PCR产物连接到pGEM-T easy载体，将连接产物转化至JM-109感受态细胞中。每份阳性样品至少挑取3个阳性克隆，并将得到的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序得到的序列在GenBank中进行BLAST检索比对分析，下载相似度高的序列，并使用MEGA 6.0软件进行多重序列比对(ClustalW法)，选用Neighbor-Joining (NJ)，Bootstrap分析重复数为1 000参数，绘制嗜吞噬细胞无浆体系统发生树。

2　结果

2.1　嗜吞噬细胞无浆体IgG检测结果

将调查地区采集的100份马血清样品进行间接荧光免疫(IFA)检测，严格按照说明书以如下的标准进行评判(图1)。检测时，采用了将样品用PBS溶液稀释64倍后镜检的方法，显微镜下观察到3个以上特异绿色荧光点即判定为阳性，共检测到了8份IgG抗体阳性样品，阳性率为8.0%(8/100)。

2.2　PCR检测结果

将上述嗜吞噬细胞无浆体IgG检测结果为阳性的相对应基因组样品,进行16S rRNA基因的扩增，将扩增产物进行克隆后测序，共有6份阳性样品测序成功，确证了嗜吞噬细胞无浆体感染。

2.3　核酸序列比较

将6份所得的嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因序列进行比对，有2种基因型ZS23(MF992253)和ZS40(MG002405)，ZS23(MF992253)相比ZS40(MG002405)存在4个碱基的突变与1个碱基的缺失，其序列相似性为99.4%。将这2条基因序列分别与GenBank中相应的序列进行相似性分析。ZS23 (MF992253)的基因序列与中国山羊检出序列(JN558816)和土耳其牛检出序列(KP745629)相似性为98.6%。ZS40(MG002405)的基因序列与美国加利福尼亚马检出序列(AF172166)相似性为98%，与中国牛检出序列(KJ782388)相似性为99%。分析结果进一步说明伊犁昭苏县的马存在嗜吞噬细胞无浆体感染，且存在的2种基因型均已在我国和周边国家报道。

A.阳性对照；B.阴性对照；C.样品(30号)；D.样品(17号)

A.Positive control;B.Negative control;C.Sample(№30);D.Sample(№17)

图1嗜吞噬细胞无浆体间接荧光免疫检测

Fig.1Indirect immunoinfluscent assay for detection ofA.phagocytophilum

2.4　系统进化分析

系统进化分析结果显示，来自马血液样品中的嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因序列均分布在同一分支上。它们与来自国内羊中的基因型(KR002113)、日本的梅花鹿中的基因型(LC060987)均处于同一分支；而与来自美国的马中的基因型(AF172165)和来自日本硬蜱中的基因型(AY909615)不在同一分支(图2)。

图2　利用16S rRNA基因序列绘制的系统进化树

3　讨论

昭苏县位于伊犁河上游特克斯河流域，植被茂密的北疆地区，是自然疫源性疫病的流行地区。历史上该地区在病原学上证实为蜱传斑点热自然疫源地[4-5]。本次调查证实了当地马场马匹血清中嗜吞噬细胞无浆体阳性率为8.0%，低于北美地区马场[6]。无浆体初次感染动物之后，感染的动物终生带菌，形成持续感染。有研究表明，持续感染过程中，病原会由于基因突变等原因产生抗原变异，逃避免疫清除[7]。由于持续感染，受感染宿主动物会持续产生抗无浆体感染抗体，这一特征有利于利用血清学方法检测无浆体的感染情况。本研究中，检测到了8份血清学阳性样品，但仅从其中6份阳性样品相对应的DNA样品中检测扩增到了16S rRNA基因序列，这有可能是由于一些受感染动物的染菌率低，导致制备的样品中菌体DNA含量过少而没能通过PCR检测到所致。然而，本研究所获得的6份阳性样品及其序列，充分证明了新疆昭苏地区的马存在嗜吞噬细胞无浆体的感染情况。该病原为人兽共患病病原，因此，当地具备由嗜吞噬细胞无浆体感染而引起公共卫生问题的风险。

本研究中，对PCR检出并测序成功的16S rRNA序列做了比对与同源性分析，结果显示，该地区嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA存在2种基因型，ZS23和ZS40，ZS40相比ZS23存在4个碱基的突变与1个碱基的缺失，其序列相似性为99.4%。同源比较分析显示，ZS23变异株的基因序列分别于与中国的山羊和土耳其牛[8]中检出序列高度同源(98.6%)。而ZS40变异株的基因序列与美国加利福尼亚马[9]和国内的牛中发现的病原序列同源。昭苏地区发现的嗜吞噬细胞无浆体与国内外其他宿主动物携带的嗜吞噬细胞无浆体较为相似，这一结果为该地区的嗜吞噬细胞无浆体的诊断防治提供了一定的依据。

嗜吞噬细胞无浆体在我国分布相当广泛，患病及携带病原宿主多样，目前在国内多个省份已有报道，临床表现复杂多样，是一种严重危害人类健康和畜牧业发展的媒介传染病。我国于2006年在安徽省发现首例人粒细胞无浆体病病例，截止目前在我国甘肃、青海、吉林、湖南、山西、北京、贵州、河南、山东、云南福建、新疆云南等省份通过血清学调查发现均有嗜吞噬细胞无浆体感染人的情况[10-17]。嗜吞噬细胞无浆体主要在宿主动物和蜱之间循环，传染源即储存宿主。宿主种类繁多，国内现已报道有多种家畜可作为本病的宿主，包括马、牛、羊等家畜[18-20]，以及鸟、鼠等野生动物[21-22]体内均有感染或携带的情况。蜱虫叮咬是嗜吞噬细胞无浆体主要的传播方式。在我国，全沟硬蜱是该病原主要的传播媒介，已从内蒙古、新疆、黑龙江和吉林的全沟硬蜱中检测到嗜吞噬细胞无浆体的16S rRNA序列[23]。因此，对嗜吞噬细胞无浆体储存宿主和传播媒介的控制将有助于防控该病在我国的流行。