XC-72/GCE修饰电极测定芹菜总黄酮的含量

曹宏梅，薛梦蝶，刘荣兰，舒适，李玲，兰月娇，刘宇博，廉国乾，袁园，赖红伟

（吉林医药学院药学院，吉林吉林 132013）

总黄酮（total flavonoids）是一类具有2-苯基色原酮（2-phenyl-chromones）结构的植物次级代谢产物，其在蔬菜中（尤其是绿叶蔬菜）含量丰富，因具有较高的药用价值和生产价值而受到国内外研究者的重点关注[1,2]。研究表明，总黄酮抗氧化活性的强弱与其含量的高低具有较高的相关性[3～6]。因此，总黄酮含量的快速检测成为热点研究课题[7～9]。

在众多的绿叶蔬菜中，芹菜（celery）是一种公认的降压食品，这与其富含的总黄酮密切相关[10]。芹菜总黄酮含量的测定目前主要以光度法和色谱法为主[10～13]。如，赵刚等采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法测定了芹菜中总黄酮的含量[10]；韩丽等采用HPLC法同时测定了新疆维药芹菜根提取物中3种黄酮类成分的含量[11]；李琨等采用高效液相色谱法研究了不同芹菜品种中黄酮的含量和分布[12]；何书美等采用红外光谱法测定了芹菜叶提取物中总黄酮的含量[13]。虽然芹菜总黄酮含量的测定取得了较大的研究进展，但以上方法仍存在着许多难以克服的弊端，为此亟待发展出一种低成本、耗时短和易操作的新方法来高灵敏地测定芹菜总黄酮。

近年来，电化学方法由于具有设备简单、快速、灵敏度高等优点而在化学分析中得到广泛应用，因而备受分析工作者的关注。与裸电极相比，诸多碳纳米材料（如单/多碳纳米管、（氧化）石墨烯、介孔碳等）修饰电极具有更好的选择性和更高的灵敏度，被成功用于多种黄酮类化合物的检测分析。如芦丁[14]、槲皮素[15]、木犀草素[16,17]、α(γ)-山竹黄酮[18]、灯盏花素[19]、金银花总黄酮[20]和毛蕊异黄酮[21]等。目前，有关XC-72导电碳黑在电分析检测中的应用鲜有报道，尤其是在天然产物分析检测领域。因此，本文制备了XC-72导电碳黑修饰玻碳电极（XC-72/GCE），应用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了芦丁在该修饰电极的电化学行为，成功实现了对芹菜总黄酮的快速检测。

1 材料与方法

1.1 原料

新鲜整株芹菜购于吉林市多客源超市，由吉林医药学院药学院赖红伟副教授鉴定为伞形科植物旱芹（Apium graveolens var.dulcedc）的全草。

芦丁标准品，上海源叶生物科技有限公司，批号153-18-4，纯度≥95%。

水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

T6新世纪型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；R-205型旋转蒸发器，上海申顺生物科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂；FA1104N型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；KDM 型控温加热套，鄄城华鲁电热仪器有限公司；索氏提取器，建湖县康达玻璃仪器有限公司；法国Bio-Logic VMP3多通道电化学工作站，大连华洋分析仪器有限公司；CHI104型3 mm直径玻碳盘电极、CHI150型饱和甘汞电极、CHI115型铂丝对电极，上海辰华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芹菜总黄酮的提取

提取芹菜总黄酮的方法及详细步骤见我们之前的工作[22]。

1.3.2 芹菜总黄酮含量的电化学测定

1.3.2.1 玻碳电极预处理

将纯玻碳电极依次用 1.0，0.3和 0.05 μm 的α-Al2O3粉末抛光，用去离子水和乙醇交替超声清洗3次，然后用氮气吹干，备用。

1.3.2.2 XC-72/GCE修饰电极的制备

精确称量2 mg XC-72导电碳黑，用1 mL 80Vol%乙醇水溶液在超声条件下分散30 min，使XC-72导电碳黑在溶液中形成黑色悬浮液。然后用微量进样器吸取10 μL上述黑色悬浮液小心滴涂在玻碳电极表面，在空气中自然晾干备用即得修饰电极。

1.3.2.3 电化学测试

采用三电极体系，其中，XC-72/GCE电极为工作电极（working electrode，WE），铂丝电极为对电极（counter electrode，CE），饱和甘汞电极（saturated calomel electrode，SCE）为参比电极（reference electrode，RE），室温下以不同 pH 值磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）为底液进行循环伏安（CV）或差分脉冲伏安（DPV）扫描。

为了作比较，本文中同时采用硝酸铝显色法测定了芹菜中总黄酮的含量。

1.3.3 数据统计分析

本文中涉及的数据统计分析均采用Origin Pro 8.5软件来完成，所有样品进行3次重复，结果以平均值表示。

2 结果与讨论

2.1 电化学反应条件的优化

2.1.1 富集时间的影响

图1 富集时间对芦丁氧化峰电流的影响Fig.1 Effects of accumulation time on the oxidation peak current of 8.2×10-4 mol/L of rutin at XC-72/GCE electrode

采用循环伏安法探究了富集时间对 8.2×10-4mol/L芦丁标准溶液氧化峰电流的影响。如图1所示，在开路条件下，随着富集时间的增加，芦丁在XC-72/GCE修饰电极上的氧化峰电流随之增大。当富集时间达到60 s时，其氧化峰电流达到最大值，其相对标准偏差（RSD）为 0.60%；继续延长富集时间，芦丁的氧化峰电流反而下降，这表明芦丁在经过60 s富集后在电极表面达到饱和。因此选择开路富集1 min作为最佳的富集时间对芦丁及芹菜总黄酮含量进行测定。

2.1.2 扫速的影响

图2 扫速对芦丁氧化还原峰电流及电位的影响Fig.2 Effects of scan rate (ν) on the redox current/potential at 8.2×10-4 mol/L of rutin

在pH值为2.0的条件下，采用循环伏安法探究了扫速对芦丁标准溶液（8.2×10-4mol/L）氧化还原峰电流及电位的影响。由图2a可知，随着扫速逐渐增加，芦丁氧化/还原峰电流随着扫速的增大而增大，与扫速（ν）呈现良好的线性关系（图2b），线性回归方程为：Ipa(μA)=7.62 ν1/2(mV/s)-26.6(R2=0.9988) 和Ipc(μA)=-7.20 ν1/2(mV/s)+25.2（R2=0.9967），表明芦丁在 XC-72/GCE修饰电极上的电化学过程属于扩散控制。芦丁的式量电位Ef（≈0.53 V）基本不随扫速变化，而 ΔEp随着扫速的增加而增大，表明芦丁在XC-72/GCE修饰电极上发生的氧化还原反应为一准可逆过程。由图2c可知，在较高的扫速下芦丁的氧化/还原峰电位（Ep）与扫速（ν）成对数关系，线性回归方程为：Epa(V)=5.2×10-2lnν+0.316（R2=0.9878）和Epc(V)=-5.0×10-2lnν+0.730（R2=0.9880）。根据 Laviron方程可计算出电子转移数（n）约为1，电子传递系数（α）约为0.51，表明芦丁在XC-72/GCE修饰电极上的电化学反应是单电子过程。

2.1.3 pH值的影响

采用循环伏安法进一步探究了 XC-72/GCE修饰电极在不同pH值下对芦丁标准溶液（8.2×10-4mol/L）的影响。

从图3a中可知，PBS缓冲溶液的pH值对芦丁的氧化还原峰电位和峰电流均有较大影响，这表明芦丁的电化学反应过程有质子参与。随着pH值的增加，氧化/还原峰电位负向移动并呈良好的线性关系（图3b），线性回归方程为 Epa(V)=-6.9×10-2pH+0.798(R2=0.9907) 和 Epc(V)=9.1×10-2pH-0.810（R2=0.9962）。从图 3c可知，芦丁氧化/还原峰电流随pH值增大而减小，这说明H+参与了化学反应。随着pH值升高，氧化/还原峰电流负向移动，线性回归方程为 Ipa(μA)=-1.7 pH+133（R2=0.9944）和 Ipc(μA)=1.5 pH-121（R2=0.9915）。当缓冲液的pH值为2.0时，测定芦丁的氧化/还原峰电流达到最大，因此选择pH值为2.0的PBS缓冲液作为底液。

图3 pH值对芦丁氧化还原峰电位及电流的影响Fig.3 Effects of pH value on the redox potential/current at 8.2×10-4 mol/L of rutin

2.2 差分脉冲伏安法测定芹菜总黄酮的含量

2.2.1 芦丁标准曲线的建立

图4 不同浓度芦丁在XC-72/GCE修饰电极上的响应Fig.4 Response of various concentrations of rutin on XC-72/GCE

采用 DPV法对一系列不同浓度的芦丁标准溶液进行测量。在最优测定条件下，测得芦丁氧化峰电流与其浓度在 4.1×10-8～1.3×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系（图 4），线性回归方程为：Ip(μA)=2.87c(µmol/L)-0.934（n=17，R2=0.9971），检出限（S/N=3）为 4.×10-14mol/L。

2.2.2 芹菜总黄酮含量的电化学测定

将 XC-72/GCE修饰电极用于芹菜总黄酮的含量测定，以标准曲线法进行测定。用加标法进行回收率实验，回收率在97.6%～100.5%之间。

为了比较，同样采用紫外-可见分光光度法测定了总黄酮含量。电化学法所测结果相当于 UV-Vis法的95.1%，这表明该法是一种新的测定芹菜总黄酮含量的有效方法。

表1 芹菜总黄酮的检测结果和回收率Table 1 Determination results and recovery of total flavonoids in celery

2.2.3 重复性、稳定性实验

采用10支XC-72/GCE修饰电极对芦丁（8.2×10-4mol/L）标准溶液测定10次，DPV峰电流相对标准偏差（RSD）为 2.35%，表明修饰电极具有良好的重复性。将该修饰电极于4 ℃的冰箱中放置4 d，测定同一浓度的芦丁标准溶液，其DPV峰电流保持在97.3%以上，表明XC-72/GCE修饰电极具有较好的稳定性。

2.2.4 干扰实验

在最佳测定条件下，采用DPV法对8.2×10-4mol/L的芦丁及芹菜总黄酮进行干扰实验，500倍的 Ag+、Fe3+、Br-、Na+、H2PO4-、K+、Mn2+、Cl-、Zn2+、SO42-、CO32-和柠檬酸对测定不干扰。50倍的麦芽糖、维生素C，维生素B1、十六烷基三甲基溴化铵、L-半胱氨酸、DL-丙氨酸、苯甲酸、蔗糖、葡萄糖和巴比妥干扰芦丁及芹菜总黄酮的测定。

3 结论

本文以廉价的XC-72导电炭黑为电极修饰材料，采用简单的滴涂法在纯玻碳电极上成功制备了XC-72/GCE修饰电极。以芦丁纯品为对照品，分别采用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究了芦丁及芹菜总黄酮在该修饰电极上的电化学行为。实验表明，XC-72/GCE修饰电极对芦丁有明显的电催化氧化作用，其氧化反应为单电子单质子过程。在最佳测定条件下，芦丁的 DPV氧化峰电流与浓度在4.1×10-8～1.3×10-5mol/L范围内呈良好线性，其线性回归方程为 Ip(μA)=2.87 c (µmol/L)-0.93（R2=0.9971），检出限为4.1×10-14mol/L；电子传递系数为0.51。该修饰电极具有制备简单，响应迅速、重复性及稳定性好、抗干扰能力强等优点，可用于芹菜总黄酮含量的电化学测定，结果令人满意。此外，本文中所建立的高灵敏电化学新方法对其他蔬菜总黄酮含量的测定具有重要的参考价值。