原因不明性复发性流产患者月经周期外周血调节性T细胞水平变化

王德胜，王曙光，冯丽燕，黄小霞，马飞

(1东莞市第五人民医院，广东东莞 523981；2中山大学附属第六医院)

原因不明性复发性流产(URSA)是一种常见的妊娠并发症，指连续发生2次或2次以上的自然流产，并排除染色体、解剖、内分泌、自身免疫功能异常及生殖道感染等病因的复发性流产，发病率为1%～2%[1]。正常妊娠类似于半同种异体移植，携带父源HLA抗原的胚胎不被母体免疫系统排斥，有赖于母胎之间建立的免疫耐受。研究证实，CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)对母胎免疫耐受的维持和正常妊娠至关重要[2]。最近研究[3,4]显示，Treg与URSA的发生密切相关，与正常孕妇相比，其在URSA患者外周血中的比例明显降低。然而，关于URSA患者外周血Treg比例在月经周期的不同阶段是否会发生规律性变化的报道相对较少。因此，本研究将针对URSA患者，在月经周期的月经期、增殖期和分泌期等不同阶段分别抽取外周血，应用多色流式细胞术探讨Treg变化规律，以期为URSA发病机制和淋巴细胞主动免疫治疗提供新的理论基础。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2015年10月～2016年12月在东莞市第五人民医院妇产科门诊就诊并诊断为URSA的患者35例为研究对象(URSA组)，年龄21～40(30.74±4.41)岁，月经周期(30.77±2.13)d，流产次数(3.66±0.87)次。URSA诊断标准：①有2次或2次以上的自然流产；②排除生殖道感染与畸形；③夫妻双方染色体分析均正常，无家族遗传病史；④女方内分泌及激素检查结果均正常；⑤无自身免疫性疾病；⑥男方精液常规正常；⑦封闭抗体阴性。选择同期在我院工作、至少有1次正常妊娠生育、招募时无怀孕的健康女职工40例为对照组，年龄21～40(31.00±5.13)岁，月经周期(31.33±2.16)d，既往无自然流产、早产、死胎或宫外孕史。两组年龄、月经周期比较差异无统计学意义，流产次数比较P<0.01。所有招募者采血时间距离末次流产或正常妊娠生育后至少3个月。本研究获得受试者的知情同意和东莞市第五人民医院伦理委员会的批准。

1.2外周血Treg检测分别于月经周期的第2～4天(月经期)、11～13天(增殖期)和21～23天(分泌期)，采集受试者外周静脉血1 mL，应用4色荧光染色和流式细胞术检测。先进行表面染色(CD3FITC/CD4APC-Cy7/CD25PE-Cy7)，然后进行胞内染色(FoxP3 PerCP-Cy5.5)。染色后重悬于0.5 mL 2%的多聚甲醛中，于24 h内上机检测，各细胞亚群的变化采用FlowJO7.6软件分析。

2　结果

URSA组月经期采血时间为月经周期的第(2.71±0.75)天，增殖期采血时间为月经周期的第(13.11±1.11)天，分泌期采血时间为月经周期的第(23.14±1.19)天，对照组分别为第(2.78±0.73)、(13.28±1.28)、(23.35±1.33)天，两组采血时间比较差异无统计学意义。两组月经周期外周血Treg水平比较见表1。

表1　两组月经周期外周血Treg水平比较

注：与同组月经期、分泌期相比，*P<0.01；与对照组增殖期相比，#P<0.01。

3　讨论

正常妊娠时，胎儿作为“半同种移植物”，不被拥有正常免疫功能的母体排斥直至足月分娩，这是生殖生物学的一个典型特征[5]。1953年，Medawa第一次提出母体免疫系统与胎儿抗原之间的关系，自此人们从免疫的角度对母胎免疫耐受的认识逐渐加深[6～8]。研究[2,9]证实，Treg对母胎免疫耐受的维持和正常妊娠至关重要。Treg作为辅助性CD4+T细胞的一个亚群，在限制机体免疫系统对抗感染、炎症和自身免疫反应的发生中起重要作用[5]。而且，临床研究[10]也发现，正常妊娠期间Treg的比例明显升高，而复发性流产(RSA)患者则无此现象。RSA指2次或2次以上的自然流产者，在计划怀孕的妇女中发生率高达5%[5]。RSA的病因十分复杂，主要包括遗传因素(包括胚胎自身发育过程中出现的异常以及遗传自父母的异常)、解剖因素、内分泌因素、感染因素、免疫功能异常、血栓前状态、孕妇的全身性疾病及环境因素等[11]。近年来，随着生殖免疫学研究的不断深入，发现约半数的RSA与免疫功能紊乱有关；根据不同因素导致免疫病理类型的差异，进一步分为自身免疫型RSA和同种免疫型RSA，由于后者仍处于研究阶段，又常常被称为URSA[11]。研究[12,13]显示URSA患者外周血及蜕膜中Treg显著降低。

本研究采用多色流式细胞术对URSA患者和健康女性月经周期不同阶段外周血Treg比例进行检测，发现两组外周血Treg在月经周期出现了典型的动态变化，两组增殖期的细胞比例均为最高。这提示，月经周期的增殖期是受孕及受精卵着床的关键时期，升高的Treg通过负调控机体的免疫功能，对母胎免疫耐受的建立可能起到关键性作用。进一步分析发现，在增殖期，URSA组Treg比例较对照组降低。之前有研究[14]发现，自发性流产的患者外周血Treg与正常妊娠女性相比无显著性差异，我们推测这可能样本的选择的月经周期的不同时期有关。上述研究外周血采集在月经周期的哪个时期不详，事实上，本研究中出现明显差异的是月经周期中的增殖期，在月经期和分泌期也无差异。越来越多的研究[15,16]显示，RSA患者外周血Treg的比例较正常妊娠女性明显降低。最近Sereshki等[4]通过对比URSA患者和对照组月经周期的增殖期和分泌期发现，对照组增殖期Treg的比例较URSA组明显升高，这与本研究结果相一致。最后，由于本研究仅对月经周期不同阶段外周血Treg所占的比例进行了检测，而其相关的功能性细胞因子如IL-10和表面抑制性受体如CD39、CTLA-4的表达并未进行研究。进一步研究URSA患者外周血Treg的功能及其表面标志在月经周期不同阶段是否会出现规律性变化，对URSA发病机制及其免疫治疗将会起到极大的促进作用。

综上所述，外周血Treg水平在URSA患者月经周期中呈现典型的动态变化，且在增殖期URSA患者的比例低于健康女性，免疫功能的紊乱在URSA发病过程中可能具有重要作用。