前列腺癌患者血清miRNA-711水平变化及意义

张仁忠，朱雯银，刘吉文，姜睿

(1西南医科大学附属医院，四川泸州 646000；2邛崃市医疗中心医院；3中国人民解放军成都军区总医院)

前列腺癌(PCa)是发达国家男性中最常见的恶性肿瘤之一[1]，寻找用于评估PCa的发展过程且具有诊断特征的指标对于PCa有效治疗至关重要。血清前列腺特异抗原(PSA)是PCa临床筛选和诊断、预后判断的重要指标，但PSA临床诊断仍具有一定的局限性，如前列腺增生等疾病等均可引起PSA水平升高[2,3]。微小RNA(miRNA)是指约22个核苷酸长度的小的非编码RNA，被认为是细胞基因表达的强大调节剂，几乎参与所有的生命活动过程[4]。同时，miRNA表达失调与许多肿瘤的发生、进展有关，被认为是所有癌症类型中较为有诊断价值和预测肿瘤预后的生物标志物[5,6]。miRNA-711是一种抑制肿瘤增殖的新型miRNA[7]，其与PCa的关系尚未见报道。本研究观察了PCa患者血清中miRNA-711的水平变化，并探讨其意义。现报告如下。

1　 资料与方法

1.1临床资料选择2015年1月～2017年5月就诊于邛崃市医疗中心医院泌尿外科、中国人民解放军成都军区总医院泌尿外科的PCa患者40例(PCa组)，年龄(64.39±7.87)岁。所有患者未接受放化疗治疗。按照美国癌症联合会(AJCC)TNM分期标准，Ⅰ期14例、Ⅱ期5例、Ⅲ期11例、Ⅳ期10例；按照Gleason分级，8～10分24例、7分7例，2～6分9例。同时选择前列腺增生(BPH)患者40例(BPH组)及健康体检男性对照者40例(对照组)，两组年龄分别为(61.85±5.39)、(57.72±6.20)岁。三组年龄比较具有可比性。本研究对象已签署知情同意书并通过医院伦理委员会批准。

1.2血清miRNA-711检测方法采用无菌抗凝管收集各组静脉血标本4 mL，提前预冷离心机4 ℃下3 000 r/min离心15 min，提取上清液2 mL，再次1 500 r/min离心3 min，提取上清无细胞液300 μL。用1 mL TRIzol试剂将血清混合,将以上混合液标本转移到1.5 mL的EP管中，室温下放置5 min。然后加入等体积的氯仿，加盖后剧烈摇晃15 s，在室温下放置5 min，4 ℃下12 000 g离心15 min。将上层水相RNA转移到另一干净的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，室温静置10 min，4 ℃下12 000 g离心10 min。离心后看到絮状胶样RNA沉淀。RNA洗涤去上清，加入0.6 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，4 ℃下7 500 g离心5 min。RNA再溶解去上清，置空气中5～10 min。用无RNase水重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，55～60 ℃静置10 min。取2 μL储存液加入另一个EP管中，再加入98 μL无RNase水，离心混匀，以无RNase水作为空白对照，测OD260/280值。OD260/280值在1.8～2.0可进行下一步实验。血清miRNA-711检测采用RT-qPCR技术。采用50 μL体积作为反应体系进行反转录反应实验，试验体系中包括5×的反应缓冲液10 μL，使用2 μg RNA模板、1 μL的RNA酶抑制剂、1 μL的反转录酶、4 μL的2.5 nmol/L dNTP Mix，加入去RNA酶水定容至50 μL。在美国罗氏公司PCR仪器上设置反转录反应程序：42 ℃条件下反应60 min，70 ℃条件下反应10 min。RT-qPCR反应体系包括：Bulge-LoopTMmiRNA RT-qPCR Primer Kit、dNTP mix、Taq酶、反转录产物、SYBR Green Ⅰ、去RNA酶水(均购自HaiGene生物试剂公司)，反应条件：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 5 s，共40个循环。Has-miRNA-711引物序列为：5′-GGGACCCTGG-GAGAGATGTAAG-3′。每个样本设3个复孔，以U6为内参，采用2-ΔCt法计算miRNA-711水平。

2　结果

2.1各组血清miRNA-711水平比较PCa组、BPH组、对照组血清miRNA-711水平分别为15.65±3.97、19.47±3.51、20.53±4.26，PCa组与BPH组、对照组相比P均<0.05。

2.2血清miRNA-711水平与PCa临床病理特征的关系见表1。

表1　　　　血清miRNA-711水平与PCa临床病理特征的关系

3　讨论

临床上，采用PSA诊断PCa会不断地增加新的PCa病例的数量，然而关于筛查PSA是否有效降低PCa的死亡风险尚未达成共识[8]。由于PSA诊断PCa特异性较低，因此找出检测PCa的特定分子标志物可能是加快PCa诊断、预后和治疗的理性方法。miRNA是一组小的非编码RNA，通过靶向相应的mRNA来转录后调节基因表达[9,10]。许多研究报道miRNA与肿瘤的发生、发展息息相关，因而与肿瘤相关的miRNA标志物成为了研究热点[11]。目前研究表明，大部分miRNA与癌症有密切的关系，其中有部分miRNA已被证明在PCa中发挥重要的作用，并且具有一定的评估预后的临床价值[12～14]。

目前，关于miRNA-711的报道较少。miRNA-711在各种不同的病理组织状况下可表现为不同的作用,如miRNA-711在乳腺癌和皮肤T细胞淋巴瘤中具有致癌性；在胃癌中是一种肿瘤抑制因子[15,16]；在HPV阳性宫颈癌细胞中被鉴定为一种新型miRNA诊断标志物[17]。除了癌症外，miR-711在外伤性脑损伤、心肌梗死和胰岛素抵抗中均具有重要的作用[16]。本研究发现，PCa组血清中miRNA-711水平低于BPH组、对照组，Ⅲ、Ⅳ期的PCa患者血清miRNA-711水平比Ⅰ、Ⅱ期者低，Gleason病理评分>7分的PCa患者血清miRNA-711水平比≤7分者低，提示miRNA-711可能参与了肿瘤细胞的发生、增殖、远处转移。通过本次研究，我们发现miRNA-711是PCa中一种新型的miRNA，可作为PCa分级、预后评估的监测因子和潜在治疗靶点，同时通过检测血清中的miRNA-711水平能有助于提高PCa早期的辅助诊断率。

综上可见，PCa患者血清miRNA-711水平降低，miRNA-711可能作为抑癌因子参与了PCa的发生与发展过程，可能是PCa诊断、预后评估的新型生物标志物，但其对PCa具体的机制仍需进一步探索。