HPLC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中胆碱、左旋肉碱、牛磺酸与肌醇

黄金凤，寻知庆，汪晨霞，郭新东*，冼燕萍，卢宇靖，吴玉銮

(1.广州质量监督检测研究院，广东 广州 511447；2.广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006)

图1 4种化合物的结构式Fig.1 Structures of four compounds

婴幼儿配方乳粉因与母乳成分较接近而被用作母乳的替代品，胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇为婴幼儿配方食品可选择添加的营养物质[1-2](结构式见图1)。其中，胆碱是强碱性有机物，为卵磷脂组成成分，在生物体内常以游离态或与卵磷脂、鞘磷脂等结合态形式存在，当体内胆碱不足时会导致生长受阻、营养不良、繁殖力差等；左旋肉碱结构与胆碱类似，其可促使长链脂肪转化为能量，缺乏时会造成细胞能量代谢的紊乱，导致肌肉无力、脂肪堆积等；牛磺酸又称α-氨基乙磺酸，能促进机体的激素分泌，增强和改善机体的免疫力，牛磺酸摄入不足会影响婴幼儿的智力或引起脑的疾病；肌醇是一种水溶性维生素，易溶于水，广泛存在于各种天然动物、植物及微生物组织中，能降低胆固醇、促进脂肪代谢等，并对脂肪肝、肝硬化、肥胖等疾病有治疗和预防作用。成人所需胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇部分可由自身合成，也可通过食物补充，而婴幼儿的各种器官未发育健全，自身合成量非常有限，绝大部分需通过食品补充。国家标准[1-2]规定了婴幼儿配方食品中胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇的添加量，胆碱添加量为1.7～12.0 mg/100kJ，左旋肉碱添加量不低于0.3 mg/100kJ，牛磺酸添加量为0～3.0 mg/100kJ，肌醇添加量为1.0～9.5 mg/100kJ。因此，建立婴幼儿配方食品中胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇的检测方法十分必要。

现有国家标准GB 5413.20-2013[3]以比色法或分光光度法测定婴幼儿食品或乳品中的胆碱；GB 29989-2013[4]使用分光光度法测定婴幼儿食品或乳品中左旋肉碱。两种方法均需酸或碱水解，将结合态或其它形式的胆碱、左旋肉碱均转变为游离态，然后进行测定。GB 5009.169-2016[5]中使用邻苯二甲醛(OPA)柱后衍生或丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法测定牛磺酸，GB 5009.270-2016[6]规定了肌醇的微生物检测或硅烷化衍生、气相色谱检测方法，但微生物法耗时长，衍生化法操作复杂，且高浓度的衍生剂较易残留从而污染仪器。其它相关文献报道的测定方法主要有高效液相色谱法[7-11]、气相色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13]、液相色谱-质谱联用法[14-16]、离子色谱法[17-18]、电化学发光法[19]、氨基酸自动分析仪法[20]等，上述方法均仅涉及1～2种分析物，每种营养素建立一套独立的检测方法，耗时相对较长，检测工作量大大增加。因此，本研究以婴幼儿配方乳粉为研究对象，采用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白后直接用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪检测。方法前处理简单快捷，其线性范围、检出限、稳定性、准确性均可满足婴幼儿配方乳粉中胆碱、左旋肉碱、肌醇和牛磺酸的分析要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DIONEX Ultimate 3000 高效液相色谱仪-Thermal TSQ Endura三重四极杆质谱仪 (HPLC-MS/MS，热电公司)，MS3 basic旋涡混合器(德国IKA公司)，KQ-250DV型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)，高速离心机(美国Sigma公司)。

标准品：氯化胆碱(纯度为98.0%，CNW公司)、d9-氯化胆碱-三甲基(TRC)、左旋肉碱(纯度≥98.0%，Dr.Ehrenstorfer公司)、d3-左旋肉碱盐酸盐(纯度为98%，Cambridge Isotop公司)、肌醇(纯度≥98.0%，CNW公司)、牛磺酸(纯度≥98.0%，CNW公司)均购于上海安谱有限公司；甲醇、乙醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸铵、乙酸锌、亚铁氰化钾(分析纯，广州化学试剂厂)；实验用超纯水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q纯水系统制备。

1.2 标准溶液的配制

分别称取各标准品及内标10.0 mg(精确至0.1 mg )，置于100 mL 棕色容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，得到质量浓度为100 mg/L 的单标储备液。分别吸取适量的单标储备液配制4种分析物的混合标准工作液，其中胆碱和左旋肉碱的质量浓度为1.0 mg/L，牛磺酸和肌醇的质量浓度为10.0 mg/L。临用时，以水逐级稀释成所需浓度的系列混合标准工作液。所有标准溶液于4 ℃冰箱中保存。

1.3 样品处理

准确称取乳粉样品0.20 g(精确至0.001 g)于100 mL比色管中，加入d9-氯化胆碱-三甲基和d3-左旋肉碱盐酸盐内标溶液(均为100 mg/L)各100 μL，加40 mL 40 ℃水溶解，涡旋1 min，超声提取10 min，加入1 mL 15%亚铁氰化钾溶液，涡旋混合均匀后，再加入1 mL 30%乙酸锌溶液，涡旋混合均匀，用水定容至100 mL，室温静置10 min后，取上清液于4 000 r/min离心3 min，经0.2 μm滤膜过滤后待检测。当测试溶液浓度超出线性范围时，可用水进一步稀释后再测定。同时做试剂空白试验(除不加样品外，其它步骤相同)。

1.4 仪器条件

高效液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相：A为5 mmol/L 乙酸铵，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～3.0 min，15%B；3.0～5.0 min，15%～70%B；5.0～6.0 min，70%～15%B；后运行时间：2 min；流速：0.20 mL/min；进样体积：5.0 μL；柱温：30 ℃。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源，正负模式切换(ESI+和ESI-)；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气：氮气，温度400 ℃；传输毛细管温度：350 ℃；毛细管电压：3 500 V(正模式)和2 500 V(负模式)；相应的电离模式、监测离子对(m/z)、碰撞电压和RF棱镜参数见表 1。

表1 化合物的MRM参数Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

*quantitative ion

1.5 样品分析物的含量计算

样品中分析物含量计算如下：Xi=(Csi-C0)V/m。式中：Xi为试样中待测目标化合物的含量(mg/kg)；Csi为待测试样溶液中目标化合物的质量浓度(mg/L)；C0为空白试验中目标化合物的质量浓度(mg/L)；V为浓缩至干后试样的定容体积(mL)；m为试样质量(g)。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

2.2.1提取溶剂的选择胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇水溶性好，可用水直接提取，但由于婴幼儿配方乳粉中含有许多水溶性蛋白质和脂溶性营养成分，基质复杂，需净化后检测。脂溶性成分不溶于水，用水提取时只需将水溶性蛋白沉淀。实验比较了乙腈、乙醇、乙酸、三氯乙酸、亚铁氰化钾/乙酸锌等沉淀剂对蛋白质的沉淀效果。结果发现，乙腈和乙醇沉淀蛋白质缓慢，沉降不完全，样品高速离心后也不澄清；乙酸和三氯乙酸对大多数乳粉样品的蛋白质沉降效果较好，但部分乳粉样品沉淀不完全；而亚铁氰化钾/乙酸锌沉淀剂对所有样品的沉淀效果好，低速离心后即可澄清。因此实验采用亚铁氰化钾/乙酸锌为沉淀剂。

2.2.2提取条件的选择比较了振荡提取和超声提取两种提取方法。结果表明，超声提取操作简便，提取效率较高。研究了超声时间分别为5、10、15、20 min时的提取率，发现超声10 min时，提取率基本达最大值，超声时间超过10 min后对提取率无显著影响。因此，确定超声时间为10 min。

2.2 质谱条件的优化

胆碱和左旋肉碱均含有季铵盐结构，分子带正电荷；牛磺酸含有氨基，在酸性条件下易加氢形成正电荷化合物[M+H]+；肌醇含有6个羟基，易形成[M-H]-母离子，因此实验选择ESI正负切换电离模式，胆碱、左旋肉碱和牛磺酸使用ESI+模式，肌醇使用ESI-模式。实验中以1.0 mg/L单标准溶液直接注入三重四极杆质谱仪，通过质谱自动优化MS/MS采集参数和特征碎片离子。表1列出了各化合物的母离子、子离子、RF棱镜参数以及碰撞能量。在优化的碰撞能下，选择每个母离子所对应丰度最大的子离子进行定量分析。

2.3 流动相条件的优化

ESI正负切换模式下检测时，流动相多使用甲醇、乙腈和水。实验比较了甲醇-水和乙腈-水流动相体系的分离效果，发现两种流动相下分析物的响应强度差别不大，但采用甲醇-水体系的峰形明显优于乙腈-水体系。此外，牛磺酸在两种流动相体系下响应均不高，而在流动相中加入乙酸铵可明显提高牛磺酸响应，且肌醇响应未见明显降低；综合考虑，实验选择甲醇-乙酸铵体系为流动相。考察了乙酸铵溶液浓度(3、4、5、6 mmol/L)对各组分分离度、响应值和峰形的影响。结果表明，乙酸铵溶液的浓度对4种组分的分离度、响应值无显著影响。由于5 mmol/L乙酸铵溶液作为水相时的峰形最好，故选择5 mmol/L乙酸铵溶液作为水相。

2.4 色谱柱的选择

胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇均属大极性亲水化合物，在常规C18色谱柱上很难实现保留，因此需选用亲水性色谱柱进行分离。实验比较了ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和BEH HILIC(2.1 mm ×150 mm，1.7 μm)的分离效果。结果发现，虽然两种色谱柱对4种化合物的保留效果均不强，但ACQUITY UPLC HSS T3保留时间的稳定性更优；由于4种化合物的提取离子色谱图之间互不干扰，可通过提取离子对各化合物进行定量，因此选择ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。在优化的HPLC-MS/MS条件下，化合物的提取离子色谱图如图2所示。

2.5 线性方程及检出限

在最优实验条件下，取质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇混合标准工作溶液进行HPLC-MS/MS检测，每个浓度标准工作液中均含100 μg/L的同位素内标溶液。胆碱和左旋肉碱采用内标法计算，以目标物定量离子峰面积(A)和内标物色谱峰面积(Ai)的比值(y)对相应的目标物质量浓度(x，mg/L)进行线性回归分析；牛磺酸和肌醇采用外标法计算，以目标物定量离子峰面积(y)对相应的目标物质量浓度(x，mg/L)进行线性回归分析，实验结果见表2。结果表明，胆碱和左旋肉碱在0.01～2.0 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数r2>0.999；牛磺酸和肌醇在0.1～2.0 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，r2>0.997。以3倍信噪比计算方法检出限(LOD)，得胆碱和左旋肉碱的LOD为1.5 mg/kg，牛磺酸和肌醇的LOD为15 mg/kg；以10倍信噪比计算方法定量下限(LOQ)，得胆碱和左旋肉碱的LOQ为4.5 mg/kg，牛磺酸和肌醇的LOQ为45 mg/kg。本方法灵敏度高，适用于婴幼儿配方乳粉中胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇的定性和定量分析。

表2 4种分析物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量下限Table 2 Standard curves,linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 4 analytes

2.6 基质效应

基质效应是由样品中复杂的干扰物抑制或增强分析物的响应导致，可用基质校准曲线的斜率与标准校准曲线斜率的比值进行评估[21-22]。由于左旋肉碱和胆碱使用内标法进行定量，内标校正了基质效应的影响，因此仅对牛磺酸和肌醇进行了基质效应研究。其标准曲线如表2所示，基质校准曲线可以通过使用样品提取液作为溶剂获得。结果表明，肌醇和牛磺酸的基质效应比值分别为0.91和0.87，表明两者的响应可能被乳粉样品中的干扰物质轻微抑制。考虑到婴幼儿配方乳粉的复杂性，实验得到的基质效应在可接受范围内。

2.7 回收率与精密度

在最优实验条件下，选取婴幼儿配方乳粉样品，分别添加3 个浓度水平的胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇混合标准工作液，按照本方法进行前处理和检测，每个浓度水平平行测定6 次，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)，实验结果见表3。4 种化合物在不同加标水平下的平均回收率为87.5%～102.4%，RSD为3.0%～7.3%。表明本方法精密度良好，能够满足婴幼儿配方乳粉中胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇的测定要求。

表3 样品的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs for analytes(n=6)

2.8 准确度

为验证本方法的准确性，实验采用质控样品进行确证。采用本方法对美国国家标准与技术研究院奶粉质控样品SRM 1849a进行3次平行检测，结果表明，所有结果均在质控样品含量范围内(表4)。

2.9 实际样品的测定

在市场上随机挑选10个品牌的婴幼儿配方奶粉(标签上均标注了该4种成分的含量)，分别采用本方法以及现行有效的国家标准方法[3-6]进行测定。结果表明，两种方法的测定结果一致(表5)，且测定结果均符合国家强制性产品标准及标签明示值的要求。

表5 实际样品的测定结果Table 5 Analytical results for the market samples (mg/100kJ)

a：obtained by national standard method；b：obtained by the developed method

3 结 论

本研究针对婴幼儿配方乳粉中胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇尚缺少方便、快速同时检测方法的现状，利用同位素内标和HPLC-MS/MS，建立了婴幼儿配方乳粉中该4种成分的同时检测方法。结果表明，胆碱和左旋肉碱在0.01～2.0 mg/L范围内，牛磺酸和肌醇在0.1～2.0 mg/L范围内线性关系良好，胆碱和左旋肉碱的检出限均为1.5 mg/kg，牛磺酸和肌醇的检出限均为15 mg/kg。样品基质加标测定结果表明该方法回收率高、精密度良好；质控样品检测以及实际样品的测定结果表明方法准确度高，能满足婴幼儿配方乳粉中胆碱、左旋肉碱、牛磺酸和肌醇的定量检测要求。

参考文献：

[1] GB 10765-2010.National Food Safety Standard Infant Formula.National Standard of the People's Republic of China (食品安全国家标准 婴儿配方食品.中华人民共和国国家标准).

[2] GB 10767-2010.National Food Safety Standard Older Infants and Young Children Formula.National Standard of the People's Republic of China (食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品.中华人民共和国国家标准).

[3] GB 5413.20-2013.National Food Safety Standard Determination of Choline in Foods for Infants and Young Children,Milk and Milk Products.National Standard of the People's Republic of China (食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定.中华人民共和国国家标准).

[4] GB 29989-2013.National Food Safety Standard Determination ofL-Carnitine in Foods for Infants and Young Children,Milk and Milk Products.National Standard of the People's Republic of China (食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定.中华人民共和国国家标准).

[5] GB 5009.169-2016.National Food Safety Standard Determination of Taurine in Foods.National Standard of the People’s Republic of China (食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定.中华人民共和国国家标准).

[6] GB 5009.270-2016.National Food Safety Standard Determination of Inositol in Foods.National Standard of the People’s Republic of China (食品安全国家标准 食品中肌醇的测定.中华人民共和国国家标准).

[7] Liu X M,Liu B,Guo Y,Shen Y,Chen B.Chin.J.FoodHyg.(刘雪梅，刘波，郭园，沈遥，陈波.中国食品卫生杂志),2016,28(2):219-223.

[8] Kagawa M,Machda Y,Nishi H.J.Chromatogr.A,1999,857:127-135.

[9] Dai C B,Li J Q,Li J X.Sci.Technol.FoodInd.(戴传波，李建桥，李健秀.食品工业科技),2007,4:222-223.

[10] Zhang Z G,Liu N,Jia Y H,Xie Y,Li Q.FoodFerment.Ind.(张志国，刘宁，贾云虹，谢焱，李琦.食品与发酵工业),2004,30(9):100-103.

[11] Li H Y,Chen X Z,Zhang S F,Zhao S H,Shao L L,Zhang D L.Mod.FoodSci.Technol.(李红艳，陈小珍，张水锋，赵素华，邵亮亮，张东雷.现代食品科技),2013,29(9):2300-2305.

[12] Cai Q X,Dai Z R,Zhang C X.J.QinzhouUniv.(蔡秋杏，戴梓茹，张晨晓.钦州学院学报),2011,26(6):44-46.

[13] Jiang R Q,Li M,Chang J J,Chen J,Hu G L,Zhou L.Sci.Technol.FoodInd.(姜瑞清，李梅，常建军，陈军，胡桂林，周琳.食品工业科技),2010,31(10):375-376.

[14] Zhu Q,Su L K,Zheng J G,Nong Y J.J.Instrum.Anal.(竺琴，苏流坤，郑家概，农云军.分析测试学报),2012,31(3):355-358.

[15] Vernez L,Hopfgartner G,Wenk M,Krahenbuhl S.J.Chromatogr.A,2003,984:203-213.

[16] Xu D M,Chen Y,Zhang J,Yu Y C,Feng F,Zhang F,Chu X G.J.Instrum.Anal.(徐敦明，陈燕，张缙，余宇成，冯峰，张峰，储晓刚.分析测试学报),2016,35(1):96-100.

[17] Chen J,Zhong X L,Yu Y H.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(陈军，钟新林，余彦海.理化检验-化学分册),2013,49(1):6-10.

[18] Zou X L,Li Y Q,Zeng H Y,Zhang J,Zheng B.J.Instrum.Anal.(邹晓莉，黎源倩，曾红燕，张婧，郑波.分析测试学报),2009,28(4):470-473.

[19] Gong S Y,Liu M,Zhu C Y,Kang W J,Shi H M,Xu X D.Chin.J.HealthLab.Technol.(龚尚于，刘明，朱辰瑶，康维钧，石红梅，徐向东.中国卫生检验杂志),2015,25(11):1685-1688.

[20] Wang H J,Zhou X Q,Feng Z Q,Zeng N Q.Mod.FoodSci.Technol.(王洪健，周兴起，冯志强，曾暖茜.现代食品科技),2012,28(3):348-350.

[21] Xun Z Q,Liu D H,Huang R R,He S,Hu D,Guo X D,Xian Y P.J.Sep.Sci.,2017,40:1966-1973.

[22] Xun Z Q,Huang J F,Li X Y,Lin S Y,He S,Guo X D,Xian Y P.Anal.Methods,2016,8:3953-3958.