免标记自增强电化学发光免疫传感器超灵敏检测河豚毒素

刘 媛，王 邃

(宁波大学 材料科学与化学工程学院，宁波市新型功能材料及其制备科学国家重点实验室培育基地，浙江 宁波 315211)

图1 河豚毒素的结构Fig.1 Structure of tetrodotoxin

河豚毒素(TTX)是一种毒性很强的小分子海洋神经毒素(结构如图1)，其分子量为319 Da，广泛分布于各种海洋生物体内[1-3]。河豚鱼组织中的河豚毒素含量高于1 000 MU·g-1时，可通过食物链在人体内积累，有效阻断神经兴奋性膜钠通道并阻碍神经传导，可导致人神经麻痹和死亡[4]。目前，河豚毒素的检测已有很多文献报道，但生物法测定比较耗时且昂贵；色谱和色谱-质谱联用法虽是国家标准方法，但对仪器和实验室的要求较高[5-6]；表面等离子体共振(SPR)技术目前尚处于研究的初期阶段，由于技术成熟度和仪器普及度等因素还难以实用化[7]；ELISA 的复杂操作和高成本也使之应用受限[8]。因此，有必要建立一种简单有效的方法检测TTX。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

实验室自组装ECL检测系统由BPCL超微弱发光分析仪(中国科学院生物物理研究所)和CHI1110B电化学分析仪(上海辰华仪器有限公司)构成。三电极体系：裸电极或修饰的玻碳电极(GCE，Φ=3 mm)作为工作电极，铂丝电极作为对电极,Ag/AgCl(3 mol·L-1KCl)电极作为参比电极。使用CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)进行电化学阻抗谱(EIS)分析。使用Hitachi SU-70扫描电子显微镜(SEM，Hitachi，Tokyo，Japan)对纳米材料的形貌进行表征。

1.2 AuNPs的制备

参照文献[18-19]，将50 mL 0.01% 的HAuCl4溶液搅拌加热至沸腾后迅速加入2 mL 1%柠檬酸钠，溶液煮沸约10 min，当颜色由黄色变成黑色再变成酒红色即得到AuNPs溶胶，冷却至室温并于4 ℃保存备用。

1.4 电化学发光免疫传感器的制备

玻碳电极预处理：依次用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉末将电极抛光至镜面，分别置于水、乙醇、水中超声各1 min，用氮气将电极表面吹干备用。

图2 电化学免疫传感器的制备流程和检测机制Fig.2 Fabrication process and detection mechanism of the ECL immunosensor

1.5 TTX的测定

TTX标准样品溶液的配制：称取5 mg 的TTX样品，溶于10 mL 醋酸(5%，质量分数),得到质量浓度为500 mg·L-1的TTX 储备液,用水稀释得到其他质量浓度的TTX标准样品溶液。

将制得的ECL免疫传感器置于100 μL 不同质量浓度的TTX 标准样品溶液中，37 ℃下孵育1 h后，用水冲洗，置于0.1 mol·L-1的PBS(pH 7.4)测试液中进行ECL测定，并记录数据。扫描电压范围为0～1.2 V，扫速为100 mV·s-1。

2 结果与讨论

2.1 材料表征

2.2 电化学发光免疫传感器的电化学行为

2.2.2电化学阻抗谱电化学阻抗也可以有效表征传感器表面的电子传递速率变化。在含有5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-和 0.1 mol·L-1KCl 的PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.4)溶液中对不同修饰电极的阻抗值进行测定。阻抗图中曲线的半圆直径越大，表明电极表面阻碍[Fe(CN)6]3-/4-电子传递的能力越大。如图4B所示,随着材料的逐级修饰，不同修饰电极(曲线a～e)的阻抗值逐渐变大，这与循环伏安的测定结果相一致，表明该生物传感器构建成功。

2.3 实验条件的优化

为获得最佳的测试条件，提高TTX的检测灵敏度，分别对缓冲溶液的pH值和目标物的孵育时间进行优化。考察了缓冲溶液pH值在6.0～8.5范围内对ECL强度的影响。结果表明，pH值在6.0～7.5范围内，ECL强度随着pH值的增加而增加，而在pH 7.5～8.5范围内，ECL强度随着pH值的增加而减小，在pH 7.5时，ECL强度达到最大。这可能是由于测试液的pH值影响蛋白质分子的活性，在强酸强碱条件下，导致蛋白质分子失活。因此，本实验选择PBS的最佳pH值为7.5。

电化学免疫传感器对抗原的孵育时间也是影响ECL强度的重要因素。本实验考察了孵育时间(15～90 min)对ECL强度的影响。结果显示，孵育时间在15～60 min范围内，ECL强度随着时间的延长而增大，在60～90 min范围内，ECL强度无明显变化。这可能是由于电极表面抗体的数量有限，孵育60 min时目标物结合已达到饱和状态。因此，选择最佳孵育时间为60 min。

图5 ECL信号随TTX浓度变化的响应图Fig.5 ECL intensities of the immunosensor after fabricating with different concentrations of TTX in 0.1 mol·L-1 PBS(pH 7.4)insert:calibration curves for TTX determination;concentration of TTX(a-h):0.01,0.1,1,5,10,50,100,1 000 μg· L-1

2.4 TTX的检测

用0.1 mol·L-1pH 7.4的PBS 配制不同浓度的TTX标准溶液，孵育完成后，置于测试底液中，考察了ECL信号响应随浓度的变化情况。如图5所示,在0.01～1 000 μg·L-1质量浓度范围内，ECL信号响应值(y)随TTX质量浓度(C)的增加而增强，其线性回归校准曲线如图5插图所示，拟合方程为y=2 528.98+653.71 lgCTTX(μg·L-1)，相关系数为0.996。TTX的检出限(S/N=3)为0.01 μg·L-1。与其他检测TTX的方法相比(见表1)，该免疫传感器具有线性范围宽和检出限低的优点。

2.5 稳定性

ECL信号的稳定是传感器用于检测的基本条件。将修饰好的电极置于100 μL 1 000 μg·L-1TTX标准溶液中孵育60 min后进行稳定性测试，考察了电压在0.2～1.2 V范围内连续循环扫描10圈的ECL信号变化情况。结果表明达到一定的扫描时间后，ECL信号趋于稳定，相对标准偏差(RSD)为2.1%，表明该免疫传感器具有很好的稳定性，适用于TTX的检测。

表1 TTX检测方法的比较Table 1 Comparison of the main methods reported for the determination of TTX

2.6 选择性与重现性

为考察该免疫传感器的选择性，在相同实验条件下，分别对100 μL浓度为10 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2、ZnCl2、葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、胆红素、溶菌酶溶液孵育过的传感器的ECL信号强度进行检测，发现其ECL信号强度与空白溶液孵育后的结果几乎相同。用河豚毒素(1 mmol·L-1)孵育过的ECL信号值约为其5倍；用包含所有上述物质的混合溶液(浓度与上述相同)进行测试，其结果与河豚毒素(1 mmol·L-1)孵育后的ECL信号强度近乎相同。实验结果表明，该免疫传感器对TTX具有良好的选择性。

将制备好的ECL免疫传感器置于4 ℃密闭保存，每2 d 于相同条件下进行ECL测量，20 d后的ECL值为初始值的97.8%，说明该修饰电极可以保持抗体的活性和数量。另选取不同批次的修饰电极对10 μg·L-1TTX进行检测，其结果的RSD为6.3%，表明该免疫传感器具有很好的重现性。

2.7 样品加标回收率的测定

实际样品溶液根据文献制得[13]。通过标准加入法，取50 μL未测得TTX的样品溶液，向其中加入50 μL不同浓度的TTX标准溶液，进行回收率测定。每份样品做3次平行实验，结果如表2所示，其回收率为98.0%～104.0%，RSD为3.5%～8.2%，表明该免疫传感器具有较好的实用价值。

表2 实际样品中TTX的检测结果(n=3)Table 2 Detection results of TTX in real samples(n=3)

3 结 论

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