降钙素原的原核表达及鉴定

蒋棚俊，吴胜昔，王玲玲，李令臣，李俊萱，曾 政，梁望旺，李 志

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054； 2.重庆市动物疫病预防控制中心， 重庆 401120)

降钙素原是由116个氨基酸组成的多肽，相对分子质量约为13 KD。它是一种糖蛋白，且无激素活性，其前肽物质是降钙素[1-3]。大多数专家和学者都认为PCT可能是一种内源性非类固醇类抗炎物质[4-5]，正常人群体内的血浆PCT水平小于0.1 ng/mL[6]。患者在局部感染、病毒性感染时，血浆PCT水平一般不会发生变化。只有在患严重型全身性细菌感染、脓毒症等疾病时患者体内的血浆PCT水平才会出现明显上升。PCT的特异性较高，可应用于各种临床症状的鉴别及诊断[7-8]。在患者体内血液中，PCT的半衰期为 25～30 h[9]，由此可见PCT的半衰期很短。1993年，PCT作为细菌感染的早期标志物在国外被首次报道[10]。目前PCT作为一个新的生物指标应用于检测感染炎症的程度,已广泛运用于细菌性感染和脓毒症的检测。2001年，PCT作为一种诊断指标被国际脓毒症会议指定在脓毒症诊断中使用[11-13]。目前PCT被广泛应用于临床检测以及指导抗生素用药，但PCT检测试剂均依赖进口，价格比较昂贵。PCT检测试剂盒的关键试剂是能与PCT蛋白特异性结合的PCT单克隆抗体，但制备高效价、特异性强的抗体必须具有免疫原性强的PCT抗原，因为PCT在人血液含量极低且半衰期短，无法采用提取的方式获得，而化学合成PCT蛋白价格非常昂贵，因此本研究拟采用基因工程方法表达PCT蛋白。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

所用大肠杆菌为BL21(DE3)、pET28a(+)质粒，重庆理工大学生物制药实验室保存；top10甘油菌、pET28a(+)/PCT重组质粒，购自上海生工生物有限公司，并测序。

1.2 实验试剂

DNA Marker，购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白质Marker，购自Thermo Scientific公司；HRP-羊抗小鼠IgG，购自北京鼎国昌盛生物有限公司；His-tag组氨酸单抗，购自美国Sigma公司。

1.3 pET28a(+)/PCT质粒的构建

通过NCBI查找PCT全基因序列，并对PCT基因序列进行优化，采用化学合成方法合成PCT基因，由上海生工进行测序。设计酶切位点(NcoI和XhoI)以及采用pET28a(+)作为表达载体。

1.4 重组蛋白的诱导表达

取少量top10甘油菌于LB液体培养基中(含卡那霉素)，摇床培养过夜，菌液采用质粒提取试剂盒提取PCT重组质粒并测定提取质粒的浓度。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，重组感受态细胞接种于5 mL的LB液体培养基中，将各培养试管按IPTG浓度梯度(0.1、0.5、1 mmol/L)和温度梯度(16、25、37 ℃)以及时间梯度(6、8、10、12 h)进行PCT重组蛋白诱导表达，超声破碎，离心，将离心所得的沉淀用适量的灭菌水溶解，煮样，将样品进行SDS-PAGE电泳分析确定PCT蛋白表达的最佳诱导条件。

1.5 重组蛋白的纯化及鉴定

按优化得到的最佳条件大规模进行诱导表达重组蛋白，采用His-tag镍柱纯化重组PCT蛋白，收集纯化所得产物，煮样后进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.6 蛋白质印记(Western blot)分析

将诱导表达的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗涤3次；以His-tag组氨酸单抗为一抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次；以羊抗鼠IgG-HRP为二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，加适量的化学发光液，红外光扫描仪成像。

2 实验结果与分析

2.1 重组载体的构建及鉴定

将重组质粒进行双酶切(NcoI和XhoI)鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示，在362 bp处有一的特异性条带，如图1所示。由图1可以得出：酶切DNA片段大小为362 bp，符合预期的结果。

M.DNA分子质量标准;1.pET28a-PCT的双酶切产物

2.2 重组蛋白诱导表达条件的优化

2.2.1 重组蛋白诱导温度的优化

在不同温度(16，25，37 ℃)诱导所得产物进行超声破菌，沉淀用适量的灭菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE电泳进行检测，可见在17 kD有一条明显的蛋白条带，与预期大小相一致，说明pET28a(+)/PCT成功表达，如图2所示。由图2可以得出：25 ℃蛋白表达量较高，可作为后续诱导条件。

M.蛋白Marker; 3.空载体; 4.16 ℃诱导上清； 5.16 ℃诱导沉淀; 6.25 ℃诱导上清；7.25 ℃诱导沉淀; 8.37 ℃诱导上清； 9.37 ℃诱导沉淀

图2 不同温度诱导诱导表达产物

2.2.2 重组蛋白诱导剂量的优化

将25 ℃条件下，使用不同浓度IPTG(0.1、0.5、1 mmol/L IPTG)诱导PCT重组蛋白表达，所得产物进行超声破菌，沉淀用适量的灭菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE电泳进行分析，结果如图3所示。由图3可以得出：在25 ℃条件下，IPTG浓度为0.5 mmol/L进行诱导，蛋白表达量最大。

M.蛋白Marker；1.空载体; 2. 0.1 mmol/L IPTG诱导上清; 3. 0.1 mmol/L IPTG诱导沉淀；4. 0.5 mmol/L IPTG诱导上清； 5. 0.5 mmol/L IPTG诱导沉淀； 6. 1 mmol/L IPTG诱导上清；7. 1 mmol/L IPTG诱导沉淀

图3 25 ℃不同浓度IPTG诱导结果

2.2.3 重组蛋白诱导时间的优化

将25 ℃条件下，在不同时间(6、8、10、12 h)对0.5 mmol/L IPTG进行诱导，所得产物进行超声破菌，沉淀用适量的灭菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE电泳进行检测，结果如图4所示。从图4可以得出：在25 ℃条件下，IPTG浓度为0.5 mmol/L进行诱导12 h时，蛋白表达量最高。

1.空载体；M.蛋白Marker；3.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 6 h诱导沉淀; 4.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 6h诱导上清；5. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 8 h诱导沉淀; 6.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 8 h诱导上清；7. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 10h诱导沉淀; 8. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 10 h诱导上清；9. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 12 h诱导沉淀；10. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 12 h诱导上清

图4 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG不同诱导时间诱导表达产物

2.3 重组蛋白的纯化及鉴定

2.3.1 重组蛋白的纯化

利用重组蛋白携带的His-tag与Ni特异性结合的原理，采用不同浓度咪唑(50、100、200、300、400、500 mmol/L)进行梯度洗脱，收集洗脱下来的蛋白。

2.3.2 重组蛋白纯化结果的鉴定

将纯化所得的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果如图5所示。从图5可以得出：100 mmol/L咪唑洗脱得到的蛋白相对分子质量大小为17 kD，与理论值相符合，100 mmol/L咪唑洗脱液可作为后续实验洗脱浓度。

M.蛋白质Marker;1.空载体；2.流穿液；3.杂蛋白；5～7.100 mmol/L咪唑洗脱液

2.4 重组蛋白的蛋白质印记分析

将纯化所得的蛋白进行SDS-PAGE电泳，再转膜，使用抗His-tag组氨酸单抗作为一抗，对PCT重组蛋白进行Western blot分析，结果如图6所示。由图6可知：在17 kD处有明显的蛋白印迹条带，而空载体在对应位置无任何条带，与预期结果相符合。通过Western blot可以看出，PCT重组蛋白的特异性较好。

1.纯化所得PCT重组蛋白；2.空载体

3 结束语

近年来，降钙素原在人体炎症中的作用机理已广泛引起了众多专家和学者的重视，特别是在全身性炎症反应、脓毒症和细菌性感染领域。健康人体在感染炎症后，患者体内的血浆PCT水平会在早期(2～3 h)发生迅速升高,因此PCT具有早期临床诊断价值[14]。

PCT在血液中的半衰期较短，无法通过提取的方式大量获得PCT蛋白，而通过化学方法合成PCT蛋白的成本过高，因此本文通过研究PCT的原核表达大量制备PCT蛋白具有重要意义。本研究选择PET28a(+)为表达载体，在制定PCT全基因合成方案的时候，在N端引入一个His-tag，方便后续的纯化工作。本研究使用成功构建的PET28a(+)/PCT重组质粒导入的top10甘油菌，提取PET28a(+)/PCT重组质粒，得到的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。设置了不同温度、不同诱导剂剂量、不同诱导时间优化PCT重组蛋白的诱导表达，筛选出的转化后的PCT工程菌在25 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白表达量最大，可作为大批量诱导表达的条件。利用His-tag亲和层析纯化大批量诱导的PET28a(+)/PCT重组蛋白，收集纯化得到的重组蛋白，采用SDS-PAGE电泳、Western blot分别对重组蛋白的纯度及特异性进行了鉴定，电泳结果显示：纯化后的PCT重组蛋白有较高的纯度，特异性良好。本研究获得的重组PCT蛋白将为后续开展PCT单克隆抗体的制备以及检测方法的研究提供良好的试剂。

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