鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对雏鸡的免疫效力研究

章振华，李 林，景小冬，张建伟，沈 佳，史爱华，郑小兰，姜北宇

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097)

鸡新城疫(Newcastle disease，ND)、传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)及H9亚型禽流感(Avian influenza，AI)是目前危害我国养禽业发展的重要的疫病，造成了巨大的经济损失[1-4]。为了有效地控制鸡新城疫、传染性法氏囊病及H9亚型禽流感的发生[5-12]，减少疫苗接种次数，在鸡新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗及鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗等研制成功的基础之上[13-14]，开展了鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+BJQ902株+WD株)(简称新法流三联苗)的研究。本试验采用本研究室制备的新法流三联苗分别免疫1、7、14、21日龄的SPF鸡和普通雏鸡，免后3周～4周采血测定ND血凝抑制抗体(haemagglutination inhibition antibody，HIAb)、IBD中和抗体(neutralizing antibody,NA)及AI(H9)HIAb，同时用IBDV BJQ902株强毒进行攻毒，观察新法流三联苗对不同日龄SPF鸡和带有母源抗体的普通雏鸡的免疫效果，以便为该疫苗的使用提供技术依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+BJQ902株+WD株)，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物免疫与预防研究室制备，批号为201301，生产日期为20130308。

1.1.2 抗原 ND血凝抑制(hemagglutination nhibition，HI)抗原、AI(H9)HI抗原及IBDV BJQ902株CEF细胞适应毒病毒抗原，均由北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物免疫与预防研究室制备。

1.1.3 攻击用强毒 IBDV BJQ902株强毒[15]，批号为20130118，毒价为106.3BID50/0.2 mL，攻毒途径为点眼、口服，剂量为每只105.0BID50。

1.1.4 试验用鸡

1.1.4.1 SPF鸡 1、7、14、21日龄SPF雏鸡，从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购入SPF鸡种蛋，在本研究室孵化出雏，饲养至所需日龄使用。

1.1.4.2 普通鸡 1、7、14、21日龄普通雏鸡，从北京礼贤日欣养殖孵化场购入京粉商品蛋鸡种蛋，在本研究室孵化出雏，饲养至所需日龄使用。

1.2 方法

1.2.1 1、7日龄雏鸡免疫试验

1.2.1.1 SPF雏鸡免疫试验 15只SPF雏鸡被分成3组，每组5只，第1组于1日龄时用新法流三联苗免疫，第2组于7日龄时用新法流三联苗免疫，每只经颈部皮下注射0.3 mL，第3组不免作为对照。在鸡只29日龄时，3组试验鸡采血测定ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb，并用鸡传染性法氏囊病BJQ902株强毒攻击，每只点眼、口服0.2 mL(含105.0BID50)，72 h后全部扑杀，检查法氏囊病变情况。

1.2.1.2 普通雏鸡免疫试验 30只普通雏鸡被分成3组，每组10只，第1组于1日龄时用新法流三联苗免疫，第2组于7日龄时用新法流三联苗免疫，每只经颈部皮下注射0.3 mL，第3组不免作为对照。在鸡只29日龄时，采血测定ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb，并按1.2.1.1项用IBDV BJQ902株强毒攻击及观察。

1.2.2 7、10、14、21日龄雏鸡免疫试验

1.2.2.1 SPF雏鸡免疫试验 52只SPF雏鸡被分成8组，第1组、第2组、第3组及第4组每组8只，分别于7、10、14、21日龄时用新法流三联苗经胸部肌肉注射途径免疫接种，每只0.3 mL；第5组、第6组、第7组及第8组每组5只，不免疫，分别为上述4个免疫组的对照组；各组试验鸡均分别隔离饲养。各组试验鸡分别在免疫接种后21 d采血测定ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb，并按1.2.1.1项用IBDV BJQ902株强毒攻击及观察。

1.2.2.2 普通雏鸡免疫试验 80只普通雏鸡被分成8组，每组10只，第1组、第2组、第3组及第4组，分别于7、10、14、21日龄时用新法流三联苗经胸部肌肉注射途径免疫，接种每只0.3 mL；第5组、第6组、第7组及第8组，不免疫，分别为上述4个免疫组的对照组；各组试验鸡均分别隔离饲养。分别在免疫接种后21 d采血测定ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb，并按1.2.1.1项用IBDV BJQ902株强毒攻击及观察。

2 结果

2.1 1日龄和7日龄雏鸡免疫试验结果

2.1.1 SPF雏鸡免疫试验结果 疫苗免疫SPF雏鸡3周～4周后，1、7日龄免疫组鸡均产生了较高水平的ND HIAb、IBD NA及AI(H9) HIAb，其滴度分别为8.0 log2、14.0 log2～14.2 log2及8.2 log2～8.4 log2，两个不同日龄免疫组鸡所产生的抗体水平基本相同，对照组为阴性；IBDV攻毒后，免疫组鸡均正常，无任何临床症状及剖检变化，均5/5保护,而对照组鸡，均5/5出现了精神沉郁、羽毛蓬松、饮食减少或废绝、排白色、黄白色水样稀便等IBD临床症状，3/5死亡，剖检病、死鸡，5/5对照组鸡均出现了明显的病理变化，表现为法氏囊水肿、出血及黄色化,肾肿大花斑状，腺胃与肌胃交界处出血，胸肌及腿部肌肉出血，肝呈黄色质脆(表1)。

表1 1日龄和7日龄SPF雏鸡免疫试验结果

2.1.2 普通雏鸡免疫试验结果 疫苗免疫普通雏鸡3 周～4周后，1日龄组免疫鸡产生的ND HIAb、IBD NA及AI(H9) HIAb抗体滴度分别为5.9 log2、12.1 log2和5.6 log2，7日龄组免疫鸡产生的抗体滴度分别为6.3 log2、12.6 log2和6.6 log2，对照组为阴性；7日龄组免疫鸡的3种抗体水平均高于1日龄组鸡；IBDV攻毒后，1日龄免疫组鸡6/10正常，无任何临床症状及剖检变化，4/10出现了IBD的临床症状和剖检变化，死亡1只；7日龄免疫组鸡10/10正常；而对照组鸡10/10出现了IBD的临床症状和剖检变化(表2)。

2.2 7、10、14、21日龄雏鸡免疫试验结果

2.2.1 SPF雏鸡免疫试验结果 疫苗免疫7、10、14、21日龄的SPF雏鸡21 d后均产生了较高水平的ND HIAb、IBD NA及AI(H9) HIAb抗体，其滴度分别为7.9 log2～8.3 log2、13.9 log2～15.8 log2及8.0 log2～8.9 log2，对照组均为阴性；比较不同日龄免疫鸡的抗体滴度，总体来说免疫日龄越大产生的抗体滴度相对越高；IBDV攻毒后，各组免疫组鸡均无任何临床症状及剖检变化，均8/8保护,而各组对照组鸡，均5/5出现了典型的IBD的临床症状和剖检变化，2/5～3/5死亡(表3)。

表2 1日龄和7日龄普通雏鸡免疫试验结果

表3 疫苗免疫7、10、14、21日龄SPF雏鸡试验结果

2.2.2 普通雏鸡免疫试验结果 疫苗免疫7、10、14、21日龄普通雏鸡3周后产生的ND HIAb、IBD NA及AI(H9) HIAb抗体滴度分别为6.1 log2～7.0 log2、12.8 log2～14.5 log2及6.0 log2～7.5 log2，对照组均为阴性；比较不同日龄免疫鸡的抗体滴度，总体来说免疫日龄越大所产生的抗体滴度相对越高；IBDV攻毒后，各组免疫组鸡均无任何临床症状及剖检变化，均10/10保护,而各组对照组鸡，均10/10出现了明显的IBD的临床症状和剖检变化(表4)。

表4 疫苗免疫7、10、14、21日龄普通雏鸡试验结果

3 讨论

用本室制备的新法流三联苗分别免疫1、7、10、14、21日龄SPF雏鸡和带有母源抗体的普通雏鸡，免疫后21 d～28 d采血测定ND HIAb、IBD NA及AI(H9) HIAb抗体，并用IBD强毒攻击，观察该疫苗对雏鸡的免疫效力。结果显示，疫苗免疫1、7、10、14、21日龄的SPF雏鸡后，ND HIAb、IBD NA及AI(H9) HIAb抗体滴度分别达到7.9 log2～8.3 log2、13.9 log2～15.8 log2及8.0 log2～8.9 log2，IBDV攻毒均100%保护，该疫苗均可使不同日龄SPF雏鸡产生较好的免疫力。而疫苗免疫1、7、10、14、21日龄带有母源抗体的普通雏鸡后，1日龄组免疫鸡产生的ND HIAb、IBD NA及 AI(H9)HIAb抗体滴度分别为5.9log2、12.1 log2和5.6 log2，IBD攻毒保护率为60%；而7、14、21日龄组免疫鸡产生的ND HIAb、IBD NA及AI(H9) HIAb抗体滴度分别为6.1 log2～7.0 log2、12.6 log2～14.5 log2及6.0 log2～7.5 log2，均高于1日龄组免疫鸡，IBDV攻毒均100%保护。将SPF雏鸡和普通雏鸡的试验结果进行比较，SPF雏鸡的免疫效果要明显优于普通雏鸡，其原因是普通雏鸡带有的母源抗体对免疫造成了一定的干扰；此外，比较不同日龄雏鸡的免疫效果，日龄越大免疫效力越好，1日龄普通雏鸡免疫所产生的免疫效力明显低于其他日龄；综上所述，新法流三联苗可使1、7、10、14、21日龄SPF雏鸡获得良好的免疫力，使1日龄普通鸡产生部分的免疫力，而使7、10、14、21日龄的普通鸡产生较好的免疫力，在生产实际中疫苗的使用对象均为带有母源抗体的普通鸡；另外，考虑到鸡传染性法氏囊病主要发生于3周龄～6周龄的雏鸡[1]，如果接种时间过晚，会错过IBD最佳保护时机。因此，推荐该疫苗对雏鸡的使用日龄为7日龄～14日龄。

根据我国养鸡生产的需求，开展了新法流三联苗的研究，该疫苗的特点是采用DF-1细胞取代传统鸡胚成纤维细胞生产的IBD抗原，显著提高了疫苗中IBD抗原含量[16]，用其制备的新法流三联苗，免疫鸡后可获得非常高的IBD中和抗体效价(达到14.0 log2～16.0 Log2)和非常好的抵抗IBDV强毒攻击的保护效果[17]。目前，我国IBD的防控主要采用中等毒力(如B87株、BJ836株等)和中等偏强毒力活疫苗(如MB株、G-61株等)进行免疫，中等毒力活疫苗尽管安全性良好，但保护力不理想，而中等偏强毒力活疫苗可导致法氏囊明显的萎缩，对养禽业带来的明显的安全性隐患[18-20]。因此，研制安全、高效的IBD疫苗成为该疫苗发展的方向。笔者在进行该免疫试验的同时，用中等毒力IBD B87株及中等毒力偏强的IBD G-61株活疫苗，分别免疫1日龄SPF及普通雏鸡，免疫后观察不同疫苗的安全性及对IBDV强毒攻击的保护力。结果IBD B87株尽管安全性良好，免疫后对鸡的法氏囊无明显的病理损伤，但其保护率仅为2/10,而IBD G-61株活疫苗可导致法氏囊明显的病理损伤，免疫后导致鸡的法氏囊明显的萎缩。试验证明新法流三联苗安全性良好，不但能有效控制IBD的发生，解决了中等毒力IBD活疫苗免疫效果差的问题，并避免了毒力偏强的IBD活疫苗使用后所带来的安全性隐患，同时还可有效控制ND及H9亚型AI的发生，一针可防3种病，该疫苗不仅可用于成年种鸡，还可用于不同品种的雏鸡，将成为养禽业中一种应用广泛的禽用灭活联苗组合。

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