猪瘟病毒NASBA-RT-LAMP快速检测方法的建立

杨平东，张明璀，曹立廷

（1.重庆荣昌高新技术产业开发区管委会，重庆 402460；2. 西南大学荣昌校区，重庆 402460）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高度接触性传染病，在全球范围内造成了巨大经济损失[1]，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须上报的动物疫病。对其检测多年来一直是兽医界研究的重点。当前的CSFV实验室检测方法主要有：ELISA、细胞培养、RT-LAMP[2]，以及以PCR技术为基础的RT-PCR、RT-nest-PCR、RT-FQ-PCR[4]等。本研究的思路来源于Fukuda等[3]2009年对诺如病毒检测方法的研究。由于CSFV基因组在总RNA提取过程中会大量损失，因此希望建立一个两步法反应，来扩增病毒RNA模板，提高检测灵敏度。首先利用核酸序列依赖性扩增技术（NASBA）可以大量扩增RNA的特点，来扩增病毒RNA模板，增加第二步反应中的模板含量，然后通过反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）进一步扩增获得检测结果，从而建立一种NASBA和RT-LAMP技术相结合的两步法检测方法（NASBA-RT-LAMP），为CSF的临床快速诊断提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 毒株与试剂

CSFV毒株：重庆市畜牧科学院兽医研究所分离保存；dNTP、NTP：购自Promega公司；蛋白酶K、Taq酶：购自上海生工；T7 RNA聚合酶、RNase H和AMV和Bst DNA 聚合酶：购自NEB公司；DTT、Betaine（甜菜碱）、MgSO4：购自Sigma公司；RNA Marker RL1000、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 4.0与Prime Script One Step RT-PCR Kit Ver 2.0 ：购自TaKaRa公司；Nucleasefree water：购自Fermentas公司。

1.2 引物设计与合成

根据测序结果，利用Primer Explorer V4设计外引物和内引物。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 NASBA-RT-LAMP方法的建立

使用RNA提取试剂盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 4.0，TaKaRa） 提 取 模 板RNA，分别优化NASBA反应中的离子浓度、引物浓度、酶含量，确定最终反应体系为20 μL（表2）。反应程序：65 ℃加热5 min，41 ℃冷却5 min；迅速加入40 U T7 RNase，5 U AMV，0.5 U RnaseH，混匀，置于41 ℃反应90 min，-20 ℃终止反应。通过5%琼脂糖电泳鉴定反应结果。

RT-LAMP反应体系（20 μL）见表3。反应程序：65 ℃水浴锅中反应1 h。取5 μL反应产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

表2 NASBA反应体系

表3 RT-LAMP反应体系

1.4 NASBA-RT-LAMP特异性检测

使用建立的NASBA-RT-LAMP方法，对临床上常见的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、乙型脑炎病毒（JEV）和CSFV进行检测。

1.5 NASBA-RT-LAMP、NASBA、LAMP与Nest-PCR灵敏度比较

以TakaRa公司提供的高纯度单链RNA片段（200 ng/μL）为标准对照，取2 μL提取的RNA模板，使用Eppendprf 6131 Biophotometer的Traycell超微量核酸检测模块测定RNA含量，用无酶水（Nuclease-free water，Fermentas）做10倍梯度稀释，分别进行NASBA-RT-LAMP、NASBA、RT-LAMP与RT-Nest-PCR反应。

2 结果

2.1 NASBA-RT-LAMP方法电泳

通过5%的琼脂糖电泳后，在900 bp处可见清晰的RNA条带（图1），说明第一步NASBA反应获得成功；然后通过2%的琼脂糖电泳，可见十分清晰的梯形条带（图2），说明整个NASBART-LAMP反应是可行的。

图1 NASBA反应的电泳图

图2 NASBA-RT-LAMP反应电泳图

2.2 NASBA-RT-LAMP特异性检测

分别用临床上常见的PRRSV、JEV和CSFV为模板，在相同条件下同时进行扩增。经琼脂糖电泳检测表明，只有以CSFV为模板，才能扩增出清晰的梯形条带，而以PRRSV和JEV为模板，不能扩增出条带，表明此方法对CSFV有很强的特异性。NASBA-RT-LAMP的特异性检测琼脂糖凝胶电泳图像见图3。

2.3 4种检测方法的灵敏度比较

图3 NASBA-RT-LAMP反应的特异性检测

比较结果显示：NASBA与RT-LAMP的最小检测浓度都为 460 pg/μL；NASBA-RT-LAMP 与RT-Nest-PCR的检测灵敏度相近，都为46 pg/μL；不过NASBA-RT-LAMP在模板浓度从460 ng/μL到46 pg/μL变化过程中，扩增条带的亮度都十分清晰（图4），而RT-Nest-PCR扩增条带却逐渐减弱，在模板浓度46 pg/μL时已非常模糊。4种检测方法的灵敏度比较结果见表4。

图4 NASBA-RT-LAMP反应灵敏度的检测

3 分析与讨论

本试验结合NASBA与RT-LAMP技术，探索建立了一种两步法检测方法，整个反应只需要恒温水浴锅即可完成。在反应过程中首先通过NASBA技术提高病毒RNA模板含量，然后进行RT-LAMP反应，最后通过琼脂糖电泳方式来验证反应结果。这样既解决了NASBA反应产物容易降解，不易电泳观察的问题，也使RT-LAMP反应的模板量增加，让RT-LAMP反应结果更加清晰、准确。

表4 4种检测方法灵敏度比较

此方法的敏感性与RT-nest-PCR相当，最小检测量为46 pg/μL，与朱俊灵等[5]将LAMP技术和横向流动试纸条技术（LFD）相结合建立的RTLAMP-LFD的灵敏度相当，但低于Das等[6]建立的针对CSFV的荧光定量RT-PCR方法。根据检测灵敏度结果分析发现，NASBA-RT-LAMP反应对CSFV检测的敏感性取决于NASBA反应的敏感性，当模板浓度在46 pg/μL时，NASBA与RT-LAMP反应通过琼脂糖电泳检测不到目的条带。这有可能是因RNA扩增量太低，不能通过电泳检测到。而NASBA-RT-LAMP反应，由于对NASBA反应得到的RNA模板进一步扩增，所以在模板浓度为46 pg/μL时仍能得到非常清晰的梯形条带。此方法

在反应过程中不需要特别贵重的设备，从而为基层

CSFV检测提供了一种新选择。

[1] MOENNIG V. Introduction to classical swine fever：virus，disease and control policy[J].Veterinary microbiology，2000，73（2）：93-102.

[2] CHEN L，FAN X Z，WANG Q，et al. A novel RTLAMP assay for rapid and simple detection of classical swine fever virus[J]. Virologica sinica，2010，25（1）：59-64.

[3] FUKUDA S，SASAKI Y，SENO M. Rapid and sensitive detection of norovirus genomes in oysters by a twostep isothermal amplification assay system combining nucleic acid sequence-based amplification and reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assays[J]. Applied & environmental microbiology，2008，74（12）：3912-3914.

[4] RISATTI G R，CALLAHAN J D，NELSON W M，et al. Rapid detection of classical swine fever virus by a portable real-time reverse transcriptase PCR assay[J].Journal of clinical microbiology，2003，41（1）：500-505.

[5] 朱俊灵，叶佐东，邓洁汝，等. 猪瘟病毒RT-LAMPLFD检测方法的建立与应用[J]. 华南农业大学学报，2016（1）：1-7.

[6] DAS A，BECKHAM T R，MCINTOSH M T.Comparison of methods for improved RNA extraction from blood for early detection of classical swine fever virus by real-time reverse transcription polymerase chain reaction[J]. Journal of veterinary diagnostic investigation，2011，23（4）：727-735.