响应面优化提取胡萝卜叶原花青素的工艺研究

黄聪亮，李淑云，陈建福

胡萝卜为二年生草本植物，以肉质根为蔬菜，在我国多地均有种植。胡萝卜肉质根采收后的其叶未被充分综合利用或直接抛弃，这样既浪费资源又污染环境。研究证实，胡萝卜叶富含维生素、原花青素、黄酮和多酚等多种成分，具有一定的功效[1]。原花青素是一类花青素类物质的聚合物，广泛存在各种植物的种子、叶子、果实、花和皮、壳等处，具有清除自由基、增强免疫系统、保护生殖功能、调节体内代谢等生理活性[2]。提取原花青素的方法主要有溶剂法、超声辅助法、超临界提法、双水相萃取法、酶法等方法，均有各自的优缺点[3]，其中超声波辅助法由于其操作简单、低温高效和安全性等优点被广泛使用[4]。本文以胡萝卜叶为原料，采用超声波辅助对其中原花青素的提取工艺进行研究，考察工艺因素(超声时间、乙醇浓度、液料比和超声温度)对胡萝卜叶原花青素提取率的影响，在单因素实验的基础上结合响应面法进行试验，优化提取工艺，为胡萝卜叶的开发利用提供一定参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料与仪器

胡萝卜叶，采购于漳州市赤湖蔬菜基地；原花青素标准品购于南京都莱生物技术有限公司；香草醛(香兰素，分析纯)购于西陇化工股份有限公司；无水乙醇、盐酸、甲醇等试剂均为国产分析纯。KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； UV-200型紫外/可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 原花青素标准曲线的绘制 采用香草醛-盐酸法，绘制得到原花青素标准曲线的回归方程为：Y=0.199 7X+0.002 9(R2=0.999 2)；其中Y表示吸光度，X表示原花青素质量浓度。

1.2.2 原花青素的超声波辅助提取工艺 将胡萝卜叶浸泡在水槽中，沉淀泥沙，再用清水淋洗2-3次，摊开沥水，于50 ℃干燥箱烘干，粉碎过筛后备用。准确称取1 g的胡萝卜叶粉末，装入100 mL圆底烧瓶中，按照实验设计的条件，加入乙醇溶液后，在固定功率100 W的超声波清洗器中提取，提取完毕抽滤，冷却，吸取1 mL滤液至10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，作为样液备用。样液代替原花青素标准溶液，测定吸光度，将标准曲线算得的原花青素浓度代入下列式子，计算得到胡萝卜叶原花青素的提取率。

式中：X为样液中原花青素质量浓度,mg/mL；V为样液定容后体积,mL；K为稀释倍数；m为胡萝卜叶质量,g。

1.2.3 单因素试验设计 设计工艺因素(超声时间、乙醇浓度、液料比和超声温度)对胡萝卜叶原花青素提取率的影响，固定液料比25 mL/g，乙醇浓度85%和超声温度60 ℃，超声时间为20、25、30、35、40、45 min，固定超声时间35 min，液料比25 mL/g和超声温度60 ℃,乙醇浓度为70、75、80、85、90、95%，固定超声时间35 min，乙醇浓度85%和超声温度60 ℃,液料比为10、15、20、25、30、35 mL/g，固定超声时间35 min，液料比25 mL/g和乙醇浓度80%，超声温度50、55、60、65、70、75 ℃。

表1 Box-Behnken响应面因素及水平

1.2.4 响应面优化试验设计 在单因素实验基础上，采用Box-behnken中心组合试验设计超声时间(A)、乙醇浓度(B)、液料比(C)和超声温度(D)四因素三水平的响应面分析试验(见表1)，以获得最优提取工艺条件[5]。

1.2.5 实验数据统计与分析 应用Excel软件和Design-Expert.V.8.0.6.1软件，分别对单因素实验数据和响应面试验数据进行处理分析，绘制原花青素标准曲线，单因素变化趋势图、建立线性回归方程、判断模型显著性。

2 结果讨论与分析

2.1 不同因素对胡萝卜叶原花青素提取率的影响

不同因素对胡萝卜叶原花青素提取率的影响见图1。从图1(1)可看出，提取率随超声时间的增加而急剧上升， 35 min达到最高，但时间继续推移，提取率呈现逐渐下降的趋势。其原因可能是到达一定时间后，温度持续上升加快分子间运动，原花青素便缓慢溶解出来；而时间过长时，长时间的过高温度破坏原花青素的结构，还夹带着其他杂质溶出，原花青素提取率就降低[6]。因此，确定35 min为最优的超声时间。从图1(2)可看出，提取率随乙醇浓度的增加而急剧上升，乙醇浓度为85%达到最高，但乙醇浓度继续增大，提取率反而逐渐下降。其原因可能是过高的乙醇浓度，使某些醇溶性、脂溶性杂质溶出量增加，与原花青素产生竞争溶出，导致提取率的下降[7]。因此，确定85%为最优乙醇浓度。从图1(3)可看出，提取率随液料比的增加而急剧上升，但液料比到达25 mL/g后提取率增加不明显。其原因可能是乙醇量到达一定数量时，反应达到动态平衡；少量的溶剂容易饱和溶液，无法完全提取有效成分，而过量的溶剂既浪费溶剂又增加杂质的含量，综合考虑确定20 mL/g为最优的液料比。从图1(4)可看出，提取率随超声温度的增加而上升， 60 ℃达到最高，但温度持续升高，提取率迅速下降。其原因可能是温度持续升高，原花青素的热不稳定性破坏其结构，损失有效的活性成分，降低提取率。因此，确定60 ℃为最优的超声温度。

图1 不同因素对胡萝卜叶原花青素提取率的影响

2.2 胡萝卜叶原花青素提取的响应面优化试验

2.2.1 模型的建立与显著性分析 按照1.2.4设计表进行响应面试验，共得29个试验点，其中24个为析因点，5个为中心点，利用Design-Expert.V8.0.6.1软件对表2数据进行拟合分析，得到超声波辅助提取胡萝卜叶原花青素的多元二次线性回归方程为：

Y=53.59+0.31A-0.043B+5.71C+1.66D+0.29AB+1.04AC-0.40AD-1.56BC+1.43BD-0.13CD-3.60A2-4.39B2-4.60C2-6.05D2

式中：Y为胡萝卜叶原花青素提取率的预测值；A、B、C、D分别代表超声时间、乙醇浓度、液料比和超声温度。

表2 响应面试验设计及测定结果

表3 回归模型的方差分析

注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)

方差分析和显著性检验结果如表3所示，该模型F值=1459.12且P<0.0001，表明该模型极显著；失拟P=0.1203 (>0.05)，差异不显著。模型的确定系数R2=0.9993，调整系数R2=0.9986，说明建立的模型能够解释99.86%响应值的变化，且有99.93%来源于所选变量。除了一次项A，交互项AB影响显著和一次项B，交互项CD影响不显著之外，一次项C、D，交互项AC、AD、BC、BD，二次项A2、B2、C2、D2均影响极显著，表明各因素与响应值之间不仅仅是线性关系。观察方程的一次项系数可以看出，影响提取率的因素主次顺序依次为液料比、超声温度、超声时间、乙醇浓度。

2.2.2 等高线图及响应曲面图分析 使用Design-Expert. V8.0.6.1软件绘制得到的等高线图和响应曲面见图2。

图2 等高线图及响应曲面图

图2(1)反映了当液料比为25 mL/g和超声温度为60 ℃时，随超声时间的延长或乙醇浓度的增大，原花青素提取率呈抛物线轨迹先增大后减小。等高线的形状趋于椭圆，响应面坡度较陡，表明超声时间和乙醇浓度两因素交互作用较为明显。在曲面图中乙醇浓度的变化幅度平缓且在等高线图中轴向等高线较稀疏，说明原花青素提取率受超声时间的敏感程度更大。图2(2)反映了当乙醇浓度为85%和超声温度为60 ℃时，随着超声时间或者液料比的增加，原花青素提取呈现先增加而后下降的趋势。等高线密集且呈现椭圆，响应面坡度陡峭，表明超声时间和液料比两因素交互强度大。曲面图里中液料比的变化坡度大，等高线图中超声时间的轴向等高线相对稀疏，说明原花青素提取率对液料比的敏感程度较大。图2(3)反映了当乙醇浓度为85%和液料比为25 mL/g时，随着超声时间的延长或者超声温度的适度提高，原花青素提取率出现先增后减的变化规律。等高线较密集且呈现椭圆，响应面坡度较陡，表明超声时间和超声温度两因素交互强度大。超声温度在曲面图里中变化坡度大，在等高线图中轴向等高线密集，说明超声温度对原花青素提取率的敏感度较大。图2(4)反映了当超声时间为35 min和超声温度为60 ℃时，一定范围内原花青素提取率随液料比或者乙醇浓度的提高而增大，加大剂量后，提取率稍有减小。等高线密集且呈现椭圆，响应面坡度陡峭，表明乙醇浓度和液料比两因素交互强度大。在曲面图里中，乙醇浓度的变化平缓，说明液料比对原花青素提取率的影响更大。图2(5)反映了当超声时间为35 min和液料比为25 mL/g时，固定乙醇浓度(或较低温度下)时，原花青素提取率随着温度的升高(或乙醇浓度的增大)先增大而后明显减小。等高线呈现椭圆，响应面坡度陡峭，表明乙醇浓度和液料比两因素交互强度大。超声温度的曲面坡度较陡且轴向等高线密集，说明超声温度对原花青素提取率的敏感度更大。图2(6)反映了当超声时间为35 min和乙醇浓度为85%时，当超声温度固定时，随着液料比的增大，提取率先增大后减小；当液料比较高时，适当提高温度可以使提取效果有效增强。等高线的形状偏向圆形，响应面坡度小，表明液料比和超声温度两因素交互作用弱。超声温度的变化曲线明显较陡，且等高线图中轴向等高线较密，说明超声温度对原花青素提取率的影响比液料比的影响更显著。

2.3 最优工艺条件的确定与验证

响应面优化提取胡萝卜叶原花青素的最优工艺条件为：超声时间35.63 min、乙醇浓度84.52%、液料比20.25 mL/g、超声温度60.57 ℃，此条件下原花青素提取率预测值为55.56 mg/g。为符合实际操作，特将最优提取条件微调为：36 min的超声时间、85%的乙醇浓度、20 mL/g的液料比、61 ℃的超声温度，进行平行验证实验，所测得提取率的平均值为54.75 mg/g，与预测值相对误差只有1.46%，验证该方法预测胡萝卜叶中原花青素的实际提取率的可靠性，具有实际应用性。

3 结 论

单因素的基础上，利用响应面设计优化胡萝卜叶原花青素提取工艺，得到液料比、超声温度、超声时间和液料比、超声时间和超声温度、乙醇浓度和液料比、乙醇浓度和超声温度以及二次项均表现为极显著，超声时间、超声时间和乙醇浓度对提取率的影响也达到显著水平，乙醇浓度、液料比和超声温度对原花青素提取率的影响不显著，且因素间的主次关系依次为液料比、超声温度、超声时间、乙醇浓度。同时，胡萝卜叶原花青素最优提取工艺条件为：超声时间35.63 min、乙醇浓度84.52%、液料比20.25 mL/g、超声温度60.57 ℃，理论提取率为55.56 mg/g。实际微调工艺条件：超声时间36 min、乙醇浓度85%、液料比20 mL/g和超声温度61 ℃，实际提取率为54.75 mg/g，与理论值相对误差为1.46%，验证了最优提取工艺的有效性，为胡萝卜叶原花青素资源利用与研究提供参考。

参考文献：

[1] 陈建福, 胡泽杰, 潘诗玲, 等. 超声波辅助双水相提取胡萝卜叶总黄酮的工艺研究[J].河南工业大学学报(自然科学版),2018,39(1): 82-77.

[2] 谢明勇, 殷军艺, 聂少平. 胡萝卜多糖结构与功能及其在食品加工过程中的变化[J]. 中国食品学报, 2016, 16(4):1-9.

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[5] 陈建福, 钟艳琴, 曾小芳,等. 响应面优化超声辅助提取胡萝卜叶总黄酮的工艺研究. 中国食品添加剂, 2017, 28(10): 66-72.

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