石油污染长期胁迫下的土壤微生物代谢活性特征研究

胡 淳，

万真真，刘海军*，周葆华

(安庆师范大学资源环境学院，安徽安庆246133)

石油作为一种复杂的多组分碳氢类化合物，主要由饱和烃、芳香烃、树脂和沥青质等4类具有不同溶解性能的物质构成[1]。石油开采、加工、转运、存储、设备维修及偶然泄露等各个环节所导致的石油污染频繁发生[2]。石油类污染物不仅可以在土壤介质中富集，还可以迁移到地下水、湖泊、湿地等环境中，而且很难从被污染的系统中清除，对自然生态系统和人类健康带来巨大的威胁[3]。王金成等研究发现，石油烃污染不仅干扰了土壤氮、磷、钾等营养元素的循环，而且影响土壤酶活性及微生物群落多样性[4]。同时，甄丽莎等利用Biolog微平板技术发现石油污染土壤微生物群落Shannon、McIntosh和Simpson等指数与清洁土壤存在极显著差异（P＜0.01）[5]。本课题组研究石油污染土壤（石油烃含量26.6 mg/g）的放线菌多样性发现，石油污染土壤放线菌拷贝数为2.1×104copies/g，较清洁土壤低3个数量级[6]。与此同时，梁玉婷等利用基因芯片技术发现随着石油污染程度的加剧，土壤总功能基因数量和多样性呈明显下降的趋势[7]。

目前，用于检测土壤微生物活性的主要方法有土壤酶活法、Biolog法、腺嘌呤核苷三磷酸ATP含量分析法、耗氧速率分析法等[8]，以上方法往往存在工作量大、操作复杂等不足。分子生物学技术的发展让我们从基因和分子水平上对复杂的土壤微生物代谢能力具有了全新的认识[7,9,11]。然而，分子生物学技术成本高的特点限制了该技术的广泛使用。微量量热法是基于能量代谢的一种新兴的能够原位实时在线和无损伤的研究生物热力学和生物动力学的生物学方法，具有灵敏度高（纳瓦级热功率）、高自动化操作和信息量大的优点[10]，而且该方法还可以满足不同层次和结构水平研究对象的需求，依次包括简单的生物分子、单纯的细胞器、特异的细胞、组织和生物个体和复杂的生态系统[11]。作为一种能够有效评价微生物代谢活性的高灵敏度技术，微量量热技术在环境微生物学、生物化学、环境科学和生态学等领域具有广泛的应用前景。然而，微量量热法在石油污染长期胁迫下的土壤微生物代谢活性方面的研究比较匮乏。基于此，本文结合FDA酶活分析法和微量量热法对油田土壤的石油污染状况进行了详细分析，以期为石油污染土壤的生态风险评估和生物修复提供重要的基础信息和理论依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集与处理

采样地区为大港油田某区块内以注水井（S1和S2）和采油井（S3、S4、S5、S6、S7和S8）为中心，直径20 m以内区域。采用随机布点法对样品进行采集，取样时，去除表层土壤，采取表层下10～20 cm土层土壤，并装入无菌塑料袋封存，每个区间采样3次，并合并作为1个样本。将土壤样本自然风干并过1 mm筛子，一部分用作石油烃含量检测和基本理化参数分析，一部分用作微量量热分析和FDA酶活性分析。所有土壤样本于实验室条件下，置于4℃恒温保存。

1.2 土壤理化特征分析

利用超声-紫外法测定石油污染土壤石油烃含量（Oil）；利用重铬酸钾氧化法检测样本的有机质含量（Organic matter，OM）；利用pH计检测样本酸碱度（土水比为1∶5）；利用重量法检测土壤样本含水率（Water）；利用凯氏定氮法测定土壤样本总氮含量（Total nitrogen，TN）并利用1N NaOH扩散法测定土壤样本有效氮含量（Nitrogen，N）；同时，利用碳酸氢钠浸提法测定土壤样本速效磷含量（Phosphorus,P）。

1.3 土壤FDA酶活性分析

用荧光素钠配制20 μg/mL荧光素标准溶液，并绘制490 nm处光密度与荧光素浓度的标准曲线。分别称取5 g过2 mm筛的新鲜土壤和150℃干热灭菌的土壤（对照）于三角瓶中。依次添加15 mLpH 7.6磷酸二氢钾缓冲液和0.2 mL1 000 μg/mL荧光素二乙酸（FDA）溶液，密封并置于30℃、200 r/min条件下振荡培养20 min；然后立即加入15 mL氯仿/甲醇溶液终止反应，以2 000 r/min转速离心2 min，并取上清液于490 nm处比色测定。

1.4 土壤微生物能量代谢分析

利用微量量热分析仪TAMIII（TA，USA）检测石油污染土壤的微生物代谢活性热功率曲线。具体过程：在安瓿管中分别添加1 g新鲜石油污染土壤和0.4 mL营养液（1.5 mg葡萄糖和1.5 mg硫酸铵），密封并置于培养温度维持在28℃的量热检测系统中，实时在线检测土壤样本的热功率随时间变化的数据，获得土壤样本热动率曲线。土壤微生物总放热量（Qtotal/J）由热功率曲线进行面积积分求得，而微生物生长速率（k/min-1）由下式求得：

其中t为微生物代谢热的在线检测时间，Pt为检测时间为t时对应的热功率，P0为微生物生长对数期的起始热功率。最大热功率（Pmax/μW）和到达最大热功率的时间（T/h）可以由热功率曲线直接读取[12]。

1.5 数据分析

利用IBM SPSS Statistics 22对土壤理化参数和生物热力学参数进行Pearson相关性分析，利用OriginPro 8软件绘制石油污染土壤的微生物代谢热功率曲线图，并利用Excel 2003绘制生物热力学参数（Pmax,Qtotal,T和k）和土壤FDA酶活性随石油污染程度变化直方图。同时，利用Canoco 4.5软件进行RDA冗余分析，以揭示石油污染土壤环境因子对采用位点分布的贡献率及石油污染对土壤微生物代谢活性的影响。

2 结果与分析

2.1 石油污染土壤基本状况

土壤中石油烃类污染物含量能够用来揭示土壤石油污染的程度。大港油田某区块注水井和产出井周边石油土壤理化状况如表1所示。注水井S1-S2周边土壤石油烃含量为0～4.1 mg/g，平均值为2.1 mg/g。而产出井S3-S8周边土壤石油烃含量范围为12.3至86.6 mg/g，同时，平均值高达47.47 mg/g。通过分析发现产出井周边的土壤石油烃含量明显高于注水井周边土壤的。Saterbak等研究发现，土壤石油烃浓度超过10 mg/g时，会明显抑制土壤蚯蚓生存和种子萌发[13]。同时，产出井周边土壤有机质含量均值为104.9 mg·g-1，远远高于注水井周边土壤的（均值7.4 mg·g-1）。结合表1中土壤理化性质分析可以发现，石油烃污染不仅能改变土壤N、P等元素的空间分布，而且能够明显影响土壤有机质组成，严重干扰了土壤微生态。因此，系统研究石油污染土壤微生物代谢活性对污染土壤的风险评估和生态修复具有重要的意义。

2.2 土壤FDA酶活性检测

作为土壤环境微生物学基本指标之一，FDA酶活性能够有效揭示土壤微生物活性及其环境微生物所栖息微生态的客观变化[14]。邢奕等研究铁矿区微生物活性特征发现土壤重金属污染程度加剧能够促使土壤FDA酶活性下降[15]；王光飞等研究发现外源低剂量生物炭可以提高土壤FDA酶活性，而高剂量的输入反而会抑制土壤FDA酶活性[16]。目前对于石油污染土壤中FDA酶活性的报道较少，本文利用FDA酶活性检测客观评价石油污染对土壤微生物能量代谢的干扰。图1反映了石油污染长期胁迫下油田土壤FDA酶活性分布特征。其中，注水井S1-S2周边土壤FDA酶活性范围为37.54～67.59 μg/g，均值高达56.41 μg/g；而产出井S3-S8周边土壤FDA酶活性分布范围为 6.16～32.13 μg/g，其均值仅有 21.40 μg/g，结果表明较高浓度石油污染会明显抑制土壤FDA酶活性，意味着石油污染严重干扰了土壤微生物的能量代谢过程。该结论与文献报道结论相一致，环境外源物质石油、重金属和生物炭等会影响土壤介质微生物代谢活性，FDA酶活性作为基本的环境微生物学指标之一，可以用来定量分析石油污染对土壤生态的影响。

表1 石油污染土壤石油烃含量及基本理化特征分析

图1 不同石油污染程度下的土壤FDA酶活性比较

2.3 土壤微生物能量代谢特征

土壤微生物热功率曲线揭示了石油污染土壤内源微生物群落在营养液激活下的能量代谢特征，如图2所示。每组功率-时间曲线（n=3）均表现出良好的重现性，客观有效地体现了每组土壤样本中微生物能量代谢的差异；而且每组曲线均具有比较完整的停滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期等，与常规的微生物培养的各生长阶段能较好吻合，意味着微量量热法能够从能量代谢角度指示复杂环境下微生物的新陈代谢规律；与此同时，在长期石油污染胁迫强度不同的情况下，各组热功率曲线存在明显差异。由图3可得，注水井S1和S2周边土壤的最大热功率Pmax分别高达511.49 μW和468.70 μW；而石油采出井（Oil＞36.2 mg/g）周边土壤Pmax明显降低，其范围为141.74 μW至209.11 μW；对所有样本的Pmax与石油污染程度进行拟合分析可以发现两者之间呈负相关性（曲线斜率-162.32，R2=0.62）。而对于土壤微生物总放热量而言，未被石油污染土壤S1样本Qtotal值为17.26 J，而轻度污染S2样本Qtotal值高达30.40 J；但是，当土壤石油含量高于12.3 mg/g时，总放热量整体呈下降趋势（-6.64，R2=0.27）。就到达对应的最大热功率Pmax所需时间T而言，注水井土壤样本时间最短，分别为820.00 min和1 061.17 min，而石油污染土壤S7所需最长时间为2 141.67 min；与此同时，时间T与石油污染程度拟合结果揭示两者之间呈正相关关系（508.40，R2=0.76），表明石油污染会抑制土壤微生物的生长代谢过程。分析发现未被石油污染的注水井S1土壤样本的微生物生长速率k值最大，达0.005 1 min-1，而石油污染最为严重的产出井S8土壤的生长速率最低，仅为0.002 2 min-1；生长速率k与石油污染程度拟合结果表明两者之间呈负相关关系（-0.0010，R2=0.78），表明石油污染对土壤微生物的生长过程具有抑制作用，干扰了土壤微生物正常的物质代谢。

图2 不同石油污染程度下的土壤微生物热功率曲线

图3 土壤微生物热动力学参数变化特征

通过对石油污染土壤的微生物代谢热功率参数 Pmax、Qtotal、T 和 k综合分析发现，Pmax、Qtotal和生长速率k与土壤石油污染程度存在负相关性，而时间T与其呈正相关性。该结果表明长期石油污染胁迫对土壤内源微生物的代谢活性影响较大，也意味着石油污染对土壤微生物群落结构造成了明显影响。由土壤总放热量变化规律Qtotal(S1)＜Qtotal(S2)，Qtotal(S2)＞Qtotal(S3-8)推测，石油污染土壤中应该存在有效降解石油烃的微生物，在轻度石油污染胁迫下，该部分具有降解功能的微生物在营养液的激活下可同时利用营养液和石油烃类进行物质代谢，从而实现自身繁殖并释放较多热量；然而，在较高石油污染浓度胁迫下，绝大部分微生物的代谢活性受到抑制，也包括具有降解功能的微生物。综合结果表明，土壤微生物能量代谢和微生物多样性研究方法在揭示石油污染对土壤内源微生物的环境行为干扰方面具有相似性。周勇等结合微量量热法和显微观察法研究了重金属锌对土壤典型真菌的影响，发现在Zn浓度为160～1 920 μg/g的土壤中微生物可以生存，并具有典型的热功率-时间曲线；而高浓度土壤（6 000 μg/g）的热功率-时间曲线仅为直线（Pmax≈0 μW），同时显微观察表明示踪真菌已经消失[16]。微量量热法作为一种灵敏的、实时在线的监测能量代谢的有效手段，在环境污染、监测和修复等方面具有广泛应用前景[17]。

2.4 土壤理化特性对能量代谢的影响

石油污染土壤理化参数与生物热力学参数的Pearson相关性分析如表2所示。

表2 石油污染土壤理化参数与生物热力学参数的Pearson相关性分析

由表2可知，石油污染土壤理化参数及内源微生物热力学参数Pearson相关性分析表明，长期石油污染干扰了土壤系统碳、氮和磷等营养元素循环。首先，石油污染土壤有机质OM含量范围为47.9～198.3 mg/g，明显高于正常土壤值；而且，污染土壤OM与石油浓度之间呈显著正相关关系（r=0.980，P＜0.01）。当油污土壤有机质含量高于85 mg/g时，石油类物质对其含量的贡献高达50%。土壤有机质作为与土壤肥力密切相关的环境因子，是土壤肥力的潜在表现，然而石油污染导致的土壤OM升高并不能有效释放营养以供环境生物生长，甚至对生命体造成毒性[8,23]。其次，对于营养元素氮而言，通过分析发现长期石油污染对土壤总氮（r=-0.186，P=0.631）和有效氮（r=-0.643，P=0.062）空间分布的影响并不明显，该结果与相关文献报道比较吻合[5]。同时，Pearson相关性分析揭示石油污染程度与土壤有效磷P之间存在明显的正相关性（r=-0.860，P＜0.01）。长期石油污染胁迫不仅干扰了土壤的营养元素循环，而且影响了土壤的水土保持能力。高浓度石油污染土壤的含水率减少到新鲜土壤的一半左右，同时，相关性表明土壤石油浓度与含水率之间呈显著的负相关性（r=-0.925，P＜0.01）。土壤含水率减少，不仅会影响土壤结构，也会严重干扰氧气和营养元素在土壤空隙中的迁移和转化。

土壤石油浓度与微生物能量代谢过程密切，石油浓度分别与Pmax（r=-0.749，P＜0.05），Qtotal（r=-0.804，P＜0.01）和k（r=-0.835，P＜0.01）呈负相关关系，而与T呈正相关关系（r=0.794，P＜0.05）。土壤水含量与微生物的代谢活性之间也表现出密切的关系，含水率与Pmax（r=0.818，P＜0.01）和k（r=0.819，P＜0.01）呈显著正相关性，与Qtotal呈正相关性（r=0.729，P＜0.05）；而与T呈负相关性（r=-0.797，P＜0.05），相关性揭示了水对土壤微生物代谢活动具有重要意义。而且，有效氮N与T呈显著负相关性（r=-0.805，P＜0.01），与k（r=0.771，P＜0.05）呈正相关性，表明有效氮在一定程度上能够加快石油污染内源微生物的能量代谢过程。速效磷P具有与有效氮N相似的结论，其不仅与Pmax（r=0.883，P＜0.01）和k（r=0.825，P＜0.01）呈显著正相关，同时与时间T呈显著负相关性（r=-0.805，P＜0.01），意味着速效磷对土壤微生物的能量代谢过程具有重要的激活作用。结合石油污染土壤的环境因子与微生物能量代谢的RDA冗余分析（如图4所示）发现高浓度的石油污染不仅改变了土壤结构，也抑制了土壤微生物能量代谢过程，而且其中含水率、速效磷和有效氮等环境因子在激活土壤微生物能量代谢过程中表现出了积极作用；总氮和土壤酸碱度对土壤微生物的代谢活性影响较小。研究环境因子与微生物能量代谢之间的关系对后续的土壤生物修复具有重要的意义。

图4 石油污染土壤环境因子与内源微生物能量代谢的RDA冗余分析

3 结论

综上所述，利用土壤FDA酶活力和微量量热技术共同分析石油污染对土壤微生物代谢活性的影响，结果表明，高浓度石油污染明显抑制了土壤FDA酶活性，改变了土壤微生物典型的热功率曲线；FDA酶活力和量热法在揭示石油污染对土壤微生物能量代谢过程中具有一致性。Pearson相关性和RDA冗余分析揭示土壤较高石油含量与微生物代谢活性呈负相关性，而土壤含水率、速效磷和有效氮等环境因子与其呈正相关性。该研究为石油污染土壤的微生物修复提供了有价值的参考信息。

[1]HASANUZZAMAN M,UENO A,ITO H,ITO Y,et al.Degradation of long-chain n-alkanes(C36 and C40)by Pseudomonas aeruginosa strain WatG[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2007,59(1):40-43.

[2]FREIDMAN B L,TERRY D,WILKINS D,et al.Permeable bio-reactive barriers to address petroleum hydrocarbon contamination at subantarctic Macquarie Island[J].Chemosphere,2017,174(1):408-420.

[3]马秋莎,刘硕,王继富,等.石油污染湿地中长链烷烃的微生物降解研究进展[J].湿地科学,2014,12(2):243-250.

[4]王金成,井明博,段春燕,等.石油烃污染对陇东黄土高原土壤生物学及非生物学特性的影响[J].水土保持通报,2017,37(1):266-273.

[5]甄丽莎,谷洁,胡婷,等.黄土高原石油污染土壤微生物群落结构及其代谢特征[J].生态学报,2015,35(17):5703-5710.

[6]刘海军,原志敏,韩俊,等.石油污染土壤非培养放线菌多样性分析[J].环境科学与技术,2014,37(11):121-127.

[7]LIANG Y,LI G,VAN NOSTRAND J D,et al.Microarraybased analysis of microbial functional diversity along an oil contamination gradient in oil field[J].FEMS Microbiology Ecology,2009,70(2):324-333.

[8]陈凯丽,吴蔓莉,叶茜琼,等.生物修复对石油污染土壤微生物活性的影响[J].农业环境科学学报,2017,36(2):279-285.

[9] DHAWI F,DATTA R,RAMAKRISHNA W.Proteomics provides insights into biological pathways altered by plant growth promoting bacteria and arbuscular mycorrhiza in sorghum grown in marginal soil[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics,2017,1865(2):243-251.

[10]刘鹏,刘义,陈酉贵,等.等温微量热法在生命科学研究中的应用[J].化学通报,2002(10):682-687.

[11]ROPELEWSKA E,ZAPOTOCZNY P,DZIEJOWSKI J.An evaluation of cellobiose as an alternative reference substance for isothermal microcalorimetry measurements of soil microbial activity[J].ThermochimicaActa,2016,623:102-106.

[12]ZHOU Y,YAO J,CHOI M M F,et al.A combination method to study microbial communities and activities in zinc contaminated soil[J].Journal of Hazardous Materials,2009,169(1–3):875-881.

[13]SATERBAK A,TOY R J,WONG D C L,et al.Ecotoxicological and analytical assessment of hydrocarbon-contaminated soils and application to ecological risk assessment[J].Environmental Toxicology and Chemistry,1999,18(7):1591-1607.

[14]刘海芳,马军辉,金辽,等.水稻土FDA水解活性的测定方法及应用[J].土壤学报,2009,46(2):365-369.

[15]邢奕,张莹莹,司艳晓,等.铁矿区重金属污染对土壤微生物代谢活性的影响[J].环境科学研究,2015,28(12):1879-1886.

[16]王光飞,马艳,郭德杰,等.不同用量秸秆生物炭对辣椒疫病防控效果及土壤性状的影响[J].土壤学报,2017,54(1):204-215.

[17]HOU G,ZHANG R,HAO X,et al.An exploration of the effect and interaction mechanism of bisphenol A on waste sludge hydrolysis with multi-spectra,isothermal titration microcalorimetry and molecule docking[J].Journal of Hazardous Materials,2017,333:32-41.