NEDD9表达变化与神经胶质瘤的恶性表型及不良预后的关系

姜红升，周彩凤，王艳洲，邢晓锋，于金然

(1.沧州市中心医院神经外四科；2.沧州市中心医院教学处，河北 沧州 061000)

神经胶质瘤是最常见的脑肿瘤，也是中枢系统常见的恶性肿瘤，可占到颅内肿瘤的一半左右，常在功能区呈浸润性生长[1]。临床上，常采用手术、放化疗或综合治疗等手段对神经胶质瘤进行治疗，以手术为主要治疗手段，但手术治疗很难一次性彻底完整切除，尤其对恶性程度高的神经胶质瘤，其预后仍不理想，复发率较高，患者生存期较短[2]。神经元细胞表达发育下调基因9(NEDD9)属于一种局灶性粘附骨架蛋白，最早在期胚胎小鼠的大脑组织中被发现，在细胞的分化、转移及凋亡中起重要作用，在调节蛋白复合物，控制细胞转移、趋化、调亡、细胞周期和分化中起重要的作[3]。相关研究[4]表明，NEDD9的高表达与大脑胶质瘤、皮肤黑色素瘤及乳腺癌等多种肿瘤的不良预后有密切关系。本研究通过分析NEDD9表达变化与神经胶质瘤的恶性表型及不良预后的关系，为寻找胶质瘤新标志物奠定基础，为临床客观、准确判断患者预后提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年10月至2012年10月沧州市中心医院收治的神经胶质瘤患者100例作为研究对象，纳入标准：(1)符合神经胶质瘤诊断标准[5]；(2)患者均为首次手术治疗，Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤患者术后给予替莫唑胺辅助化疗；(3)术前未接受放化疗；(4)签署知情同意书。根据病理诊断恶性程度分为低度恶性组(WHO分级为Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤)和高度恶性组(WHO 分级为Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤)，每组各50例，同时收集因重度颅脑外伤患者50例作为对照组。低度恶性组中：男性32例，女性18例，年龄30～68岁，平均(46.24±6.82)岁；高度恶性组中：男性33例，女性17例，年龄32～67岁，平均(45.85±7.36)岁；正常对照组中：男性30例，女性20例，年龄30～69岁，平均(46.16±7.35)岁。各组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，研究经本院伦理委员会审批并通过。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 神经胶质瘤患者手术切除的胶质瘤标本，对照组行内减压而切除的脑组织，置入液氮中冰冻，并存放于-80℃冰箱备存，所有标本都用石蜡包埋。

1.2.2 免疫组化法检测NEDD9表达情况 采用免疫组织化学方法观测脑组织标本中NEDD9的表达，使用切片机(德国Leica公司)将石蜡包埋组织切成4 μm厚度，二甲苯液脱蜡后依次采用95%、90%、85%乙醇水化，蒸馏水浸泡5 min后加入3%过氧化氢溶液50 μL，20 ℃下孵育10 min， PBS冲洗3次，加入50 μL的一抗4 ℃下过夜后，加入二抗20 ℃下孵育10 min，采用DBA试剂盒(美国KPL公司)中的试剂进行显色，放入显微镜下观察，显色后用蒸馏水洗掉，终止显色，采取苏木素复染2 min，中性树胶封片。

1.2.3 NEDD9 mRNA及蛋白表达检测 采用qRT-PCR技术检测脑组织NEDD9 mRNA的表达：(1)从冰箱中取出标本组织20 mg，研磨成粉末状；(2)严格按照Trizol试剂(美国 Invitrogen 公司)说明书提取组织总RNA；(3)采用反转录试剂盒(加拿大Fermentas公司)配置反应混合物，反转录合成环状DNA；(4)荧光实时定量RT-PCR反应反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s， 60 ℃退火30 s，40个循环，相关引物序列(上海生工公司)见表1；(5)PCR产物经EB染色和2%琼脂糖凝胶电泳后，采用紫外分析仪进行观察，并采用HMIAS-2000系统进行定量分析，用NEDD9 mRNA与GAPDH的灰度比值表示NEDD9 mRNA的相对表达水平。采用Western-blot法检测脑组织NEDD9蛋白的表达：(1)采用改良异硫氰酸胍法提取脑组织总蛋白，-70℃下冻存；(2)将40 μg总蛋白溶入等体积的缓冲液中煮沸10 min，经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离蛋白；(3)将蛋白质转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上；(4)NC膜置入封闭液中振荡封闭30 min(室温20℃)，漂洗3次(每次30 min)后加入NEDD9抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG稀释液摇匀后，采用免疫荧光增强法(ECL)试剂盒(北京普利莱基因有限公司)检测NEDD9蛋白的表达，同样的方法检测β-actin的表达作为内参照。

表1 NEDD9与GAPDH引物序列表

1.3 评价标准

采用免疫组织化学的方法对脑组织的NEDD9蛋白表达情况进行检测，以阳性细胞数占总数的比率和染色强度进行评分：(1)0分：无阳性细胞；(2)1分：阳性细胞百分比<5%；(3)2分：5%<阳性细胞百分比≤20%。(4)3分：阳性细胞百分比>20%；对染色强度进行评分：(1)0分：无染色；(2)1分：淡黄色；(3)2分：棕黄色；(4)3分：棕褐色。将两者的评分相乘得到总分，并将总分>4分定义为高表达，总分≤4分定义为低表达[6]。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 免疫组织化学法结果比较

免疫组织化学染色实验结果显示，在对照组的脑组织中NEDD9蛋白的表达极低，在低度恶性组和高度恶性组中NEDD9表达较高，且高度恶性组明显高于低度恶性组(图1)。免疫组织化学评分结果显示，对照组、低度恶性组和高度恶性组的NEDD9蛋白评分为1.89±0.42、3.12±1.03、8.12±1.03，对照组<低度恶性组<高度恶性组(P<0.05)。

2.2 各组NEDD9 mRNA及蛋白表达情况

RT-PCR结果显示，对照组、低度恶性组和高度恶性组的NEDD9 mRNA相对表达量为0.23±0.07、0.42±0.08、0.79±0.12，对照组<低度恶性组<高度恶性组(P<0.05)；Western-blot结果显示，见图2。

2.3 患者5年生存情况比较

NEDD9高表达组患者平均生存时间为26.35个月(95%CI 20.15～29.94)，NEDD9低表达组患者平均生存时间39.94个月(95%CI 32.25～46.38)，低表达组5年生存时间明显高于高表达组(χ2=9.876，P<0.001)，见图3。

2.4 神经胶质瘤患者5年总生存时间的相关因素分析

多因素COX回归分析显示，恶性程度(HR=1.936，P=0.007)、肿瘤全切除(HR=1.073，P=0.018)、NEDD9蛋白表达(HR=2.415，P=0.009)是神经胶质瘤患者5年总生存时间的独立危险因素(P<0.05)，见表2。

表2 神经胶质瘤患者5年总生存时间COX回归分析

因素HR95%CIP值年龄(<60岁/≥60岁)1.1230.675～1.9520.107性别(男/女)0.7530.207～0.9590.153肿瘤部位1.3151.106～3.8540.348恶性程度(低/高)1.9361.396～3.5420.007肿瘤全切除1.0731.005～2.2120.018NEDD9蛋白表达(低/高)2.4151.103～5.3470.009

3 讨论

神经胶质瘤属于临床最常见的脑肿瘤，是起源于胶质细胞的神经外胚层肿瘤，通常生长部位较深，且呈浸润性的生长，具有难以治愈、病程短、患者生存质量差及死亡率高的特点[7]。神经胶质瘤临床主要表现为：头痛、恶性呕吐、神经功能缺失、视乳头水肿、偏瘫、精神性格改变及共济失调等，易出现远处转移[8]。目前对神经胶质瘤首选的治疗手段为手术切除，但术后半年左右易复发，此时患者神经功能损伤加重，神经结构破坏范围扩大，患者意识水平下降，最终诱发脑功能衰竭进而发生死亡[9]。恶性程度高的患者预后极差，其平均中位生存期通常约一年左右[10]。

上个世纪90年代初，NEDD9首次被提出，其又称Cas-L，属于骨架蛋白的CAS家族蛋白成员，在介导细胞信号转导中起到重要作用[11]。NEDD9在多种肿瘤的发生发展中起作用，其可与多个细胞信号通路(BCAR3、CHAT-H、AND-34等)发生作用，促进肿瘤细胞趋化、迁移、侵袭和转移[12]。本研究经免疫组织化学法实验结果显示，在对照组脑组织中NEDD9蛋白的表达极低，在低度恶性组和高度恶性组中NEDD9表达较高，尤其在高度恶性胶质瘤组织中呈高表达状态，这是因为NEDD9是前致癌基因FAK激酶的特异性效应分子，其通过对蛋白复合体(Fascin蛋白)进行调节，调控细胞的粘附、迁移和侵袭、凋亡及细胞周期，从而促进肿瘤细胞迁徙及侵袭。高表达的NEDD9可导致Fascin蛋白发生结构性重组，促使应力纤维性结构形成，从而实现细胞骨架重塑，破坏细胞间及细胞与细胞外基质间的正常粘附性，使细胞粘附性下降，细胞的运动性增强，促进肿瘤细胞迁移侵袭能力增强，随着NEDD9持续的高表达，最终胶质瘤恶性演变[13-14]。

本研究经qRT-PCR和Western blot实验结果显示，NEDD9 mRNA及蛋白相对表达量在各种的表达为：对照组<低度恶性组<高度恶性组(P<0.05)，这说明了NEDD9 mRNA及蛋白相对表达量与神经胶质瘤的恶性演变有关，在正常脑组织中其表达很微弱，随着神经胶质瘤的恶性的递进而呈上调趋势，且在高度恶性胶质瘤中呈高表达状态。NEDD9会提高与细胞外基质的结合，促进肿瘤细胞的生长增殖，当NEDD9呈高表达时，会激活一些下游效应分子(氨基端激酶、细胞外信号调节激酶及丝裂原激活的蛋白激酶等)，从而促进细胞迁移及侵袭，同时NEDD9也会刺激细胞产生更多的金属蛋白酶 2(MMP-2)和基质金属蛋白酶 9(MMP-9)，而MMP-2或MMP-9会降解细胞基质，进一步增加生长因子及细胞因子的作用，促进恶性肿瘤的侵袭转移[15]。因此临床上可通过基因靶向治疗下调NEDD9 的表达水平来削弱肿瘤细胞的转移能力，阻断或延缓神经胶质瘤的恶性演变进程。

本研究通过对神经胶质瘤患者预后影响因素进行分析，Cox回归多因素分析结果显示，NEDD9蛋白表达(HR=2.415，P=0.009)是神经胶质瘤患者5年总生存时间的独立危险因素(P<0.05)，胶质瘤生存率会随其恶性程度的升高而降低，这与国内外相关研究结果相一致，是影响患者预后的危险因素，并意味着NEDD9可能是一个有用的神经胶质瘤标志物，可作为一个独立的患者预后指标。

综上所述，NEDD9表达程度与神经胶质瘤发生发展关系密切，在胶质瘤的恶性进展中扮演重要角色，NEDD9高表达可预测神经胶质瘤患者长期不良预后。

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