高效液相色谱法测定保健食品中葛根素含量

苏思尹，郭菊玲

（云南省玉溪市食品药品检验所，云南 玉溪 653100）

葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，有升阳解肌、透疹止泻、除烦止渴、清火排毒、调血脂等功效，故被广泛应用于保健食品中。市售保健食品质量标准中主要以检测总黄酮为功效指标，但由于葛根素有改善外周循环、抗血小板聚集等临床药理作用，长期、大量使用可能存在潜在的出血风险，故建议在功效指标中增加标志性成分葛根素的含量测定，以保证产品的安全性[1－2]。本研究旨在遴选保健食品中葛根素的含量测定方法，以控制功效成分，更合理、安全地开发和利用葛根资源。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司)，配备 G1322A在线脱气机，G1311A四元泵，G1329A自动机样机，G1316A柱温箱，G1315D二极管阵列紫外检测器；Sartorius TB－215D型及T－214型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；HU10260F型超声仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。

1.2 试药

葛根素对照品（批号为 110752－200912，含量为96.0%，购自中国食品药品检定研究院）；甲醇为分析纯（德国Merck公司）；乙醇为化学纯（天津医药化学有限公司）；水为超纯水（实验室自制）；18批次不同厂家含有葛根药材（或葛根素）的保健品(市场抽验品)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[3]

色谱柱：Agilent Lichrospher C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 水（25 ∶75）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；检测波长：250 nm。

2.2 溶液制备[4]

对照品溶液：称取葛根素对照品26.06 mg，精密称定，置25mL容量瓶中，加30%乙醇溶液适量，超声20 min溶解，冷却至室温，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取供试品1.0 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液至30 mL，超声20 min，冷却至室温，用 30%乙醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取 2.2项下对照品溶液0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00，5.00 mL，分别置10 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液稀释并定容至刻度，按拟订色谱条件进样测定，以峰面积（A）为纵坐标（Y）、质量浓度（μg/mL）为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程 Y＝0.025 4 X＋1.481 4，r＝1.000 0（n＝7）。结果表明，葛根素质量浓度在 4.803 8 ～ 960.768 0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限和定量限确定：精密量取质量浓度为4.8 μg/mL 的对照品溶液 1 mL，置 100 mL 容量瓶中，用30%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀。依次改变进样量，测定出定量限和检测限。信噪比（S/N）约为1∶3时，进样量为 5 μL，测定检测限绝对值为 0.24 ng；S/N 约为1 ∶10 时，进样量为 35 μL，测定定量限绝对值为 1.68 ng。重复进样5次，结果的 RSD为3.02%（n＝5）。

精密度试验：精密吸取质量浓度为96.076 8 μg/mL的对照品溶液，依法连续进样6次，测定峰面积。结果的RSD为0.08%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品（同仁堂牌同仁益健茶）溶液，分别于 0，1.5，3，6，12，24，48 h 时进样，测定葛根素峰面积。结果的 RSD为 0.68%（n＝7），表明常温下供试品溶液在48 h内稳定性良好。

重复性试验：取供试品（纽斯葆牌葛维片），按2.2项下方法平行配制6份供试品溶液，每份各进样2次，取平均值，依法测定含量。结果的 RSD为2.35%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的供试品（百邦葛灵胶囊）粉末9份，每份约0.5 g，精密称定，分为3组，每组分别加入质量浓度为 0.576 0 g/L的对照品溶液0.8，1.0，1.2 mL。按 2.2 项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1。

表1 葛根素加样回收试验结果（n＝9）

2.4 样品含量测定

取18批次保健品，按2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定峰面积，计算样品含量。结果见表2。

2.5 样品处理方法及色谱条件选择

测定方法选择：18批保健品中均含有葛根药材或葛根提取物，但检测标准中仅有4批测定葛根素功效成分，且有的标准还存在同一指标有多种检验方法的现象，而不同检验方法测定结果存在较大差异[5－6]。结果见表3。由于目前国产保健食品多以中草药为原料，而且组分复杂，因此，在检测标志性成分葛根素时，采用专属性较强的高效液相色谱（HPLC）法，以保证检测结果的可靠性[7－10]。

提取方法选择：供试品前处理考虑了超声、回流、索氏3种提取方法，试验发现，超声提取效率明显高于其他2种，这与文献报道的黄酮类提取方法结果一致，且方便、快捷。

表2 样品含量测定结果

表3 不同方法样品含量测定结果

流动相选择：试验中比较了乙腈－水（11∶89，流动相 A），甲醇 －水（25∶75，流动相 B）对样品测定的影响，发现以乙腈－水为流动相时峰形较好，但部分样品杂质峰与主峰不能完全分离，致使样品含量及加样回收率均偏大。比较结果见表4。使用甲醇－水作为流动相时，分离效果明显（供试品溶液色谱图理论板数不低于 5 000，样品中待测组分与相邻峰的分离度大于1.5），能保证主峰的分离度，故选用甲醇 － 水（25 ∶75）为流动相。

表4 不同流动相样品含量测定结果

提取溶剂选择：试验中比较了酸加入水解黄酮苷对提取率的影响，随着pH的增加含量变化不大，故借鉴了2015年版《中国药典（一部）》葛根素含量测定方法，直接采用30%乙醇作为提取溶剂。

3 讨论

试验中，有的供试品平行操作的2份样品含量精密度较差，重新取样配制后测定，精密度仍不能改善，究其原因可能是：供试品制剂本身均匀度较差，制剂在分装前未混匀，超声溶解时难免会出现溶解不充分的现象；个别供试品制剂中的辅料，造成葛根素的峰有一定程度的拖尾，导致积分后的峰面积稍有差异[11]。

本研究中建立的高效液相色谱法操作简单，检测快速，分离度好，结果准确可靠，可用于检测保健食品中葛根素的含量，以有效控制保健品中该功效成分。

[1]GB/T22251－2008.中华人民共和国国家标准[S].

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