直链烷基苯磺酸钠对雌性小鼠卵巢类固醇激素合成的影响*

刘小强 ，李 丹 ，王 琦 ，任春娥

（1.山东省青岛市妇女儿童医院，山东 青岛 266034； 2.山东省青岛市中心医院，山东 青岛 266031；3.潍坊医学院附属医院，山东 潍坊 261031）

生殖健康为目前日益凸显的医疗难题，环境污染可引起生殖细胞损伤而导致胎源性疾病发生，继而影响胚胎发育和新生代健康[1－2]。表面活性剂为人工合成的化学洗涤剂，日常应用频繁，可通过人体直接接触、餐具、蔬果残留等多种途径进入人体。直链烷基苯磺酸钠（linear alkylbenzene sulfonate，LAS）是常见化学洗涤剂中的表面活性剂成分，在人体内含量虽小，但难以消除，长期蓄积会影响动物生殖系统[3－4]。LAS暴露对机体生殖系统的作用受到其暴露的浓度、时间、体内代谢方式等多种因素的影响，而在现实生活中受实验技术及伦理学等限制，LAS暴露对宫内胚胎及生育功能影响的研究难以展开，主要通过小鼠等动物进行研究[5]。为明确LAS对雌性子代生殖系统的影响，本研究中通过LAS染毒妊娠小鼠，观察其子代类固醇激素合成情况及可能机制，为预防和干预LAS对生殖系统的影响提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试药

1.1.1 动物

40只妊娠小鼠均来源于南京大学模式动物研究中心，实验动物许可证号为scxk（苏）2010－0001，购买后均单笼饲养，自由摄食和饮水，昼夜节律正常。本研究符合伦理学标准，并经我院伦理学委员会审核批准。

1.1.2 仪器与试药

详见表1。

表1 仪器与试药名称及其来源

1.2 方法

1.2.1 分组

将40只小鼠进行编号，并按随机数字表法分为研究组和对照组，各20只。分组信息贴于笼子显眼位置，避免后续处理错漏。两组小鼠的性别、妊娠时间、入组时体质量等一般资料比较均无明显差异（P＞0.05），具有可比性。详见表2。

表2 两组小鼠一般资料比较（n＝20）

1.2.2 给药

研究组于妊娠第5～20天以生理盐水为溶剂，每天以 150 mg/kg LAS（CAS号为 25155－30－0）灌胃染毒，灌胃溶液体积为每10 g体质量 1 mL，期间每5天称1次体质量，并相应调整灌胃溶液体积。对照组小鼠同期每天以等量生理盐水灌胃。

1.2.3 子代分娩及处理

两组小鼠均饲养至分娩，期间无死亡，均正常分娩。选出两组子代雌性小鼠，饲养条件同母代小鼠，饲养、观察子代雌性小鼠发育情况至10周龄，子代雌性小鼠发情间期颈椎脱位处死，取血和卵巢于液氮中速冻冷藏。

1.2.4 血清指标检测

取获得的血液标本以3 500 r/min的转速和3 cm半径离心处理10 min，分离出上层血清，用于相关指标检测，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测并比较两组子代雌性小鼠血清卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）及睾酮（T）等类固醇激素水平和血清超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）等氧化应激指标水平，操作均由同一相关检测经验3年以上检验科人员进行，具体操作严格仪器及试剂盒说明书进行。

1.2.5 聚合酶链反应（PCR）检测和电泳分析

取子代雌性小鼠卵巢，Trizol法常规提取总RNA后逆转录合成 cDNA，以β－actin作为内参照，对卵巢中类固醇激素急性调节蛋白（StAR）、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（P450scc）mRNA相对表达量进行检测，其中StAR上游引物为5′－CTGCTAGACCAGCCCATGGAC －3′，下 游 引 物 为 5′－TGATTTCCTTGACATTTGGGTTCC －3′，片段大小 546 bp；P450scc上游引物为5′－ TCCAGAGGACCCAGGTTCAA －3′，下游引物为 5′－CATCAGGTGTCAAATCTTGGACTT －3′，片段大小 496bp；β－actin 上游引物为 5′－TAAAGACCTCTATGCCAACACAG － 3′，下游引物为 5′－ CACGGATGGAGGGGCCGACTCATC － 3′，片段大小 241 bp。反应体系 20 μL，含2 μL 的 10 × Taq Buffer，1.5 μL 的 25 mmol/L MgCl2，1 μL 的 10 mmol/L dNTP，1 μL 的 10 pmol/μL 相应上游引物，1 μL 的 10 pmol/μL 相应下游引物，1.5 μL 的cDNA 模板，10.5 μL 的 DEPC 水，0.5 μL 的 1 U/μL Taq酶。具体 PCR 反应条件：StAR：94℃4 min、94℃0.5 min、50 ℃ 0.5 min、72 ℃0.5 min、72 ℃5 min，共35 个循环；P450scc，94 ℃4 min、94 ℃0.5 min、50 ℃0.5 min、72 ℃0.5 min、72 ℃5 min，共 30 个循环；β－actin反应条件与目的条件一致。取5 μL PCR产物常规行凝胶电泳，紫外灯下拍照后采用Image pro Plus图像分析系统计算光密度值，将目的基因与β－actin基因光密度值比值为目的基因相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件分析。计量资料均符合正态分布，组间比较采用独立样本 t检验，采用Pearson线性相关分析法分析研究组子代雌性小鼠血清氧化应激指标水平与其血清类固醇激素水平，以及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组子代性别

两组小鼠均为单胎妊娠。研究组子代雌性小鼠13只，雄性7只；对照组子代雌性小鼠15只，雄性5只。

2.2 两组雌性子代血清类固醇激素、氧化应激指标水平及卵巢不同mRNA相对表达量

与对照组子代雌性小鼠比较，研究组子代雌性小鼠的血清FSH，LH，E2，T等类固醇激素水平，血清SOD活力，以及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量均降低，血清MDA水平则升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3、图1和图2。

表3 两组子代雌性小鼠血清类固醇激素、氧化应激指标水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量比较（n＝20）

图1 两组子代雌性小鼠卵巢StAR及mRNA相对表达量

2.3 研究组雌性子代血清氧化应激指标与类固醇激素及卵巢不同m RNA相对表达量的相关性

Pearson线性相关分析结果显示，研究组子代雌性小鼠血清 SOD活力与其血清FSH，LH，E2，T等类固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量均呈正相关（r＝0.866，0.805，0.798，0.836，0.818，0.897，P＜0.05），其血清MDA水平与前述类固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量则呈负相关（r＝－0.811， －0.835， －0.872， －0.818， －0.806， －0.857，P ＜ 0.05）。

3 讨论

图2 两组子代雌性小鼠卵巢P450scc mRNA相对表达量

本研究中采用LAS灌胃妊娠小鼠，并以生理盐水灌胃为对照，观察了胚胎期LAS暴露对子代小鼠卵巢类固醇激素合成的影响。结果显示，相对于生理盐水对照组，LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠的血清FSH，LH，E2，T等类固醇激素水平及卵巢 StAR和 P450scc mRNA相对表达量均降低，其机制可能为LAS导致的生殖细胞结构破坏和凋亡导致类固醇激素合成能力降低，可引发生殖系统功能紊乱，降低生殖系统功能。LAS为表面活性剂的主要成分，而表面活性剂在日常洗涤中应用普遍，因此人体普遍暴露在LAS中，虽量较小，但长期蓄积可能对人体造成一定影响[6－7]。人体中生殖器官极易受到环境因素的影响，而胚胎期及青春期生殖系统发育高峰若受到化学污染物的影响可影响生殖细胞功能，导致体内内分泌异常，影响生殖系统激素合成分泌，影响生殖功能[8－10]。窦晓卫等[11]和韩海艳等[12]的研究均证实了LAS在生殖能力上的负面作用，这与本研究结果一致。故对LAS相关生殖系统不良影响进行防治十分重要，明确LAS在生殖系统中的具体影响及其机制可为其相关不良影响的防治提供依据。

LAS进入人体后需氧化降解，因此可引发体内自由基水平的明显升高，从而导致脂质过氧化增强和抗氧化酶活力降低[13]。已有研究证实，LAS可引发抗氧化能力的降低而导致肝脏功能损伤[14－15]。因此，氧化应激的增强亦可能为LAS影响卵巢类固醇激素合成的重要途径。本研究中亦关注了LAS对子代雌性小鼠氧化应激状况的影响，结果显示，相对于生理盐水对照组，LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠的血清SOD活力降低而血清MDA水平则升高，其氧化应激反应严重，而抗氧化应激能力降低，进一步证实了“LAS通过促进氧化应激导致妊娠小鼠的子代雌性小鼠卵巢类固醇激素合成功能降低”的假设，亦与赵文红等[14－15]的研究中LAS通过氧化应激途径影响细胞功能，造成器官损伤的结论一致，提示抗氧化可能为减轻LAS对机体造成不良影响的途径。

本研究结果显示，随着LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠血清 SOD活力的降低，其血清 FSH，LH，E2，T等类固醇激素水平同步降低，而随着血清MDA水平的升高，其血清FSH，LH，E2，T等类固醇激素水平规律下降[16]，提示其氧化应激指标可能与血清类固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量相关。进一步的Pearson线性相关分析结果显示，研究组子代雌性小鼠血清SOD活力与其血清类固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量均呈正相关，其血清MDA水平与其血清类固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相对表达量则呈负相关，受LAS影响妊娠小鼠的子代雌性小鼠氧化应激状态异常，且与其类固醇激素水平和卵巢类固醇激素合成能力相关，进一步证实了胚胎期LAS通过促进氧化应激导致妊娠小鼠的子代雌性小鼠卵巢类固醇激素合成功能降低。

综上所述，LAS可影响雌性小鼠卵巢类固醇激素合成，而氧化应激可能为LAS影响卵巢类固醇激素合成的机制和干预依据。在LAS暴露广泛的情况下，适当抗氧化干预可能减少其对子代卵巢类固醇激素合成的影响，改善子代生殖系统功能，尚需进一步研究证实。

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