清热神芎丸中黄连质量控制方法研究

王 建，李正国，刘琳琳，卞艳晶

（山东省济宁市食品药品检验检测中心，山东 济宁 272025）

清热神芎丸收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂(第四册)》[1]，由大黄、川芎、黄连、黄芩等7味药物组方，有消肿止痛、通便泻火功效。标准中收载了显微鉴别和黄连的薄层鉴别方法，但尚不能对药品的质量进行有效控制。黄连是清热神芎丸方中主药之一，具有清热燥湿、抗菌消炎、利胆等药理作用[2－4]。本研究中在考察制剂中黄芩、大黄质量控制方法的基础上[5－6]，参考文献[7－11]，以黄连的主要有效成分盐酸小檗碱和盐酸巴马汀为指标，优化色谱分离条件，建立测定该制剂中两指标含量的高效液相色谱（HPLC）法，并制订了合理的限度。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1200型高效液相色谱仪，AgilentG1314CDAD型紫外检测器(安捷伦公司)；XS205DU型十万分之一电子分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；BS110S型万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SK8200LHC型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（批号为0752－200206，含量为86.7%），盐酸巴马汀对照品（批号为 110756－200110，含量为86.1%），购自中国食品药品检定研究院；清热神芎丸（批号分别为 20141013，20140525，20140906，20141004， 20140316， 20140811， 20141005， 20140620，20140105， 20140314，20140808， 20140127， 20140316，20141027，20140203，20140227，山东方健制药有限公司）；按照处方工艺，取黄芩、大黄、川芎等制备不含黄连的阴性样品。甲醇、乙腈均为色谱纯（天津四友精细化学品有限公司）；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Gold C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 － 0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（每1 000 mL中加入十二烷基硫酸钠4 g，以磷酸调节pH至 4.0；45 ∶55）；检测波长：345 nm；柱温：25 ℃。理论板数按盐酸小檗碱计算应不低于3 000。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：称取盐酸小檗碱对照品12.01 mg、盐酸巴马汀对照品11.28 mg，精密称定，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇适量溶解，定容，摇匀，作为对照品贮备液。再分别精密吸取上述盐酸小檗碱贮备液15 mL，盐酸巴马汀对照品贮备液2 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取本品 0.50 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－盐酸（100∶1）溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 35 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇 － 盐酸（100 ∶1）溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按处方量及制备工艺制备不含黄连的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得。

对照药材溶液：称取黄连对照药材0.05 g，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3 方法学考察

专属性考察：精密吸取2.2项下4种溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样分析。结果供试品溶液色谱中，在与盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对照品溶液色谱相同保留时间处有相应吸收峰，阴性对照品溶液色谱则无此吸收峰，表明处方中其他药味对测定无干扰(见图1)。

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，进样测定。以进样量(X，μg）为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得盐酸小檗碱回归方程为 Y＝1 328.727 X－2.505(r＝0.999 979，n＝6），盐酸巴马汀为 Y＝1 404.406 X－0.625(r＝0.999 984，n＝6）。结果表明，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀进样量分别在 0.125 0 ～0.749 7 μg 和 0.015 5 ～ 0.093 2 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样5次。结果盐酸小檗碱和盐酸巴马汀平均峰面积分别为 415.968±3.324 和 53.836±0.420，RSD 分别为0.80%和0.78%(n＝5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批样品5份，依法制备供试品溶液，进行测定。结果盐酸小檗碱的平均含量为（0.5768±0.003 55）mg/g，RSD 为 0.62%(n ＝5)；盐酸巴马汀平均 含 量 为 （2.225 0 ± 0.014 5）mg/g， RSD 为 0.65%(n＝5)。表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，每隔1 h测定1次，测定10次。结果盐酸巴马汀、盐酸小檗碱平均峰面积分别为 83.635 和 332.310，RSD 分别为 0.55% 和0.45%(n＝10)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

加样回收试验：精密吸取混合对照品溶液2 mL（含盐酸巴马汀 0.150 2 mg、盐酸小檗碱 0.541 8 mg）6 份，置具塞三角瓶中，挥干甲醇。取已知含量的样品6份，分别置上述具塞三角瓶中，依法制备供试品溶液，测定盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量，计算回收率。结果见表1。

图1 专属性考察高效液相色谱图

2.4 样品含量测定

取16批样品，每批2份，均按2.2项下方法操作，制备供试品溶液。按拟订色谱条件进行测定。结果见表 2、图 2和图 3。

2.5 耐用性试验

流动相pH考察：调节流动相的pH分别为 4.0，4.2，3.8，按供试品测定方法测定，结果见表 3。结果显示，流动相 pH适量变化，不影响2种成分的分离度和测定结果。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

表2 样品含量测定结果（n＝2）

图2 16批次样品中2种成分含量分布图

图3 16批次样品中2种成分比值分布图

表3 流动相pH考察

流动相比例考察：以乙腈－0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相，分别组成 45∶55，50∶50和52∶48的流动相进行测定，结果见表4。可见，流动相中乙腈用量减少，2种成分保留时间延长，分离度增加；乙腈用量增加则保留时间缩短，流动相组成比例的适量变化不影响测定结果。

柱温考察：分别设置柱温为20，25，30℃，对样品分离效果进行考察，结果见表5。可见，20℃时影响盐酸小檗碱色谱峰峰面积的积分值，色谱分离效果降低，保留时间延长，故选柱温为25℃。

表4 流动相比例考察

检测波长考察：分别以343，345，347 nm为检测波长进行测定，结果见表6。可见，波长的适度变化不影响含量测定。

色谱柱考察：在色谱分析中，以色谱柱的类型和规格对分离效果影响较大。本研究中分别选用Agilent EclipseXDBC18柱（250mm×4.6mm，5μm）[色谱柱（Ⅰ）]、Thermo Hypersil Gold C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）[色谱柱（Ⅱ）]和 WatersSunFireTMC18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）[色谱柱（Ⅲ）]进行考察，结果 2种成分均可有效分离，但色谱柱（Ⅲ）色谱峰保留时间长。结果见表7。

表5 柱温考察结果

表6 检测波长考察结果

表7 色谱柱考察结果

3 讨论

3.1 测定条件选择

检测波长选择：经二极管阵列检测器(DAD)在线检测，盐酸小檗碱和盐酸巴马汀在345 nm波长处均有较强吸收，故以345 nm为检测波长。

流动相选择：选用 Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）为色谱柱，参考文献[2]，以乙腈 －0.1%磷酸溶液、乙腈 －0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液和乙腈－0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相进行检测，结果本研究中所用流动相色谱法分离效果最好，黄连主要成分得到有效分离，可用于多成分测定。

提取方法选择：以甲醇－盐酸（100∶1）为溶剂，分别采用超声提取样品和超声提取后过中性氧化铝柱2种方法制备供试品溶液。结果测得盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量相同，均可用于该产品的含量测定，但应对所使用中性氧化铝进行考察。第1种样品处理方法较简便，故选择本研究中选定的方法。但样品溶液经中性氧化铝柱处理后，样品中黄连的5个色谱峰分离较好，可除去其他杂质色谱峰，可用于黄连的液相色谱鉴别。

提取时间考察：取样品4份，每份约 0.5 g，精密称定，分别置具塞三角瓶中，分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述方法测定，计算样品中盐酸巴马汀与盐酸小檗碱的含量，结果提取30，45，60 min的效果基本一致，故选用30 min。

3.2 测定结果分析

16批样品的HPLC色谱图有5个主要色谱峰，与黄连对照药材的色谱峰一致，盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量呈正相关，15批样品中2种成分含量的比值基本一致，比值的平均值为 3.88，RSD为 2.4%，其中 1批次样品（批号 20140203）2成分比值较低(3.64)。可知样品所用黄连品种基本一致。样品中2种成分含量的总和存在较大差异，7批次样品总含量在 1.68～3.055 mg/g之间；9 批次样品总含量在 1.19～1.45 mg/g 之间。2010年版《中国药典(一部)》规定黄连中以盐酸小檗碱计含小檗碱（C20H17NO4）不得少于 5.5% ，巴马汀（C21H21NO4）不得少于 1.5%。按最低含量计算，制剂中小檗碱与巴马汀的含量分别不得低于 2.00 mg/g和0.55 mg/g。本研究中显示，所测样品中有3批次符合要求，其他批次2种成分均偏低，需进一步对生产工艺和原料进行研究，确定合理限度。因此，亟待建立该产品中黄连的质量控制方法，以保证产品质量。

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