咪喹莫特联合高强度聚焦超声治疗小鼠黑色素瘤实验研究

陈英华 ，伍 烽 ，W.R.Chen，卫 佳 ，吴丽美 ，李星星 ，周 兰 △

（1.重庆医科大学生物医学工程系·重庆市生物医学工程学重点实验室·重庆市超声医学工程重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，重庆 400016； 2.Biomedical Engineering Program，Department of Physics and Engineering，College of Math and Science.University of Central Oklahoma，USA 73034）

目前，恶性黑色素瘤在我国发病率逐年上升[1－2]。其恶性程度极高、侵袭性强，极易发生局部进展及转移，易失去手术机会，且传统放射治疗（简称放疗）、化学治疗（简称化疗）效果不佳，免疫治疗虽在一定程度上延长了患者的生存时间，但治疗反应率较低[3]。咪喹莫特（imiquimod，IMQ）为非核苷类异环咪唑喹啉胺类免疫调节剂，对人和动物的病毒性微生物和肿瘤具有显著的治疗作用，其与物理治疗的联合应用可以降低单纯物理治疗后的复发率[4]。还有研究发现，IMQ乳膏经皮给药与瘤内注入树突状细胞联合治疗皮肤恶性黑色素瘤效果较好[5]。Redondo等[6]在冷冻手术联合IMQ治疗黑色素瘤小鼠模型中发现，小鼠的干扰素α(IFN－α)诱导和T细胞免疫反应均有增加，增加了自身免疫的抗肿瘤能力，为其临床治疗黑色素瘤提供了免疫学依据。高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）是一种无创治疗方法，在实体肿瘤的治疗中已得到广泛应用[7－9]，但目前临床仍未将黑色素瘤列为HIFU的适应证。李欢等[10]的研究结果表明，HIFU处理能抑制黑色素瘤原发灶的生长，并减少原发灶残留的瘤细胞脱落入血和减少血循环中瘤细胞在肺部的定植。另有研究表明，HIFU除可以杀灭肿瘤细胞、破坏肿瘤组织外，还可增加宿主抗肿瘤免疫功能[11]。本研究中采用IMQ联合HIFU治疗恶性黑色素瘤，旨在为获得更理想的治疗方案提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

动物及细胞株：无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雌性 C57BL/6小鼠 60只，4周龄，购自重庆医科大学动物中心（动物生产许可证编号为SCXK 2007－0001）；小鼠黑色素瘤细胞株 B16细胞株，购自中国典型培养物保藏中心（编号为MCC017）。实验获得重庆医科大学实验动物伦理委员会的批准；饲养条件为屏障环境（SPF级动物设施）；实验过程按照重庆医科大学动物实验中心的流程操作。

仪器及试药：CZF－1型聚焦超声治疗仪（重庆海扶技术有限公司）；小鼠TNF－α ELISA试剂盒（批号为555268），小鼠 IFN －γ ELISA 试剂盒（批号为 555138），均购自 BD Biosciences公司。咪喹莫特（IMQ）购自 3M Health Care Limited公司（批号为 H20160079）。

1.2 方法

建模及分组：4周龄C57 BL/6系雌性小鼠皮下接种黑色素瘤细胞株B161×107个/mL的单细胞悬液0.1mL。此时记为第1天，观察瘤体生长，瘤体平均直径第5天为3 mm，第7天为5 mm。荷瘤对照组（A组）15只。IMQ组（B 组）15 只，第 5 天开始外用 IMQ，分别于第 5，6，8，9天各擦1次，均匀涂抹，每个肿瘤每次5 mg。HIFU组（C组）15只，第7天进行HIFU处理，每只小鼠用HIFU处理 1次，治疗头频率为 9.5 MHz，声功率为 4.5 W；焦距为 6～8 mm，施治 20 s，停 20 s，重复 9次。IMQ 联合HIFU组（D组）15只，第5天开始外用IMQ，方法同前；第7天进行HIFU处理1次，方法同前。

肿瘤生长曲线及疗效分析：每组取10只小鼠，观察各组小鼠治疗后的生存时间，并绘制曲线。

小鼠脾淋巴细胞提取：治疗后14 d，每组取5只小鼠，采用“眼球摘除法”获取外周血后，使小鼠处于失血性休克状态，置75%乙醇中浸泡2 min，在无菌环境下取3组荷瘤小鼠的脾脏。取出的脾脏立即置200目铜网上碾碎，采用RPMI 1640液冲洗铜网，并收集细胞悬液。采用Ficoll－Paque梯度离心法得到脾脏淋巴细胞[12]。在37℃及5%CO2培养箱中孵育，并在培养液中加入鼠白细胞介素 2（mIL－2），终浓度为 200 U/mL。培养3 h后取悬浮细胞，弃除贴壁细胞，用RPMI 1640完全培养液调细胞密度为2×106/mL，待用。

测定脾脏淋巴细胞细胞毒性：96孔培养板每孔加入密度分别为 1×105个/mL和 2×106个/mL的 B16肿瘤细胞及脾细胞液各0.1 mL，细胞混匀后，在37℃及5%CO2、饱和湿度条件下共孵育48 h后采用台盼蓝排斥法染色计数活细胞，计算，淋巴细胞细胞毒性＝(对照组活细胞数－试验组活细胞数)/对照组活细胞数×100%[13]。试验设3个复孔，重复3次。

培养上清液细胞因子检测：将各组脾淋巴细胞与肿瘤细胞共培养48 h后离心，留取培养上清液，于－80℃冰箱保存。ELISA法[14]检测上清液中IFN－γ和TNF－α含量。按试剂盒说明书操作，重复3次。

1.3 统计学处理

采用SAS8.0统计学软件分析。计量资料用表示，采用方差分析，组间两两比较采用 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果见表1至表3。各组中位生存时间及95%置信区间（CI）分别为：A 组，29 d 和（27.8～30.5）d；B 组，65 d和（61.2 ～ 67.8）d；C 组，29 d 和（26.3 ～ 31.5）d；D 组，113 d和（105～127）d。D组的小鼠生存率高于其他组。

表1 各组脾淋巴细胞对B16细胞的细胞毒性比较（n＝15）

表2 各组脾淋巴细胞与B16细胞共培养后上清液TNF－α水平变化比较（n＝15）

3 讨论

机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展有密切关系，当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发病率高，而在肿瘤进行性生长时，患者的免疫功能受抑制，两者互为因果。恶性肿瘤患者免疫功能低下，机体处于免疫功能抑制状态。尽管多数的肿瘤都表达了一种或多种肿瘤相关抗原（TAA），但却能通过多种机制逃脱免疫系统的监视和攻击。理想的肿瘤治疗方法应是既能精确破坏局部和全身的肿瘤细胞，又能全面恢复机体的免疫功能，使已失常的抗肿瘤免疫功能重新恢复正常，形成治疗肿瘤和恢复机体正常功能的良性循环，减少肿瘤的复发和转移[15－17]。

表3 各组脾淋巴细胞与B16细胞共培养后上清液IFN－γ水平变化比较（n＝15）

辅助性 T 淋巴细胞（t－helper lymphocyte，Th） 及其分泌的细胞因子在免疫调节中具有重要作用。体内Th1免疫活性下降而Th2升高，将导致细胞免疫障碍、基因突变、癌基因被激活及端粒酶活性改变等，导致受感染的细胞异常增生，最终发展为癌症[18－19]。另外，分化的Th1和Th2两个细胞亚群，各自分泌不同的细胞因子，均能刺激自身分化和发展而抑制对方的分化和发展，相互影响。Th1型细胞因子IL－2和IFN－γ，能刺激CTL的增殖和分化，IFN－γ可增强NK细胞的杀伤能力，TNF等可直接杀伤肿瘤细胞等，从而抑制肿瘤的发展[20－21]。

IMQ对肿瘤细胞的作用主要是通过免疫调节机制诱导多种免疫相关细胞的细胞因子表达和分泌，增强机体的天然与获得性免疫应答来发挥的，其作用于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等细胞的TLR7，促进细胞分泌 IL－12，IL－1β，TNF－α，IFN1等细胞因子，参与固有和适应性免疫应答，可增强机体抗病毒和抗肿瘤效应；研究表明 ，TLR4，TLR2，TLR7/8 等受体的活化性配体可直接或间接调节Treg的功能，可逆转DC诱导的Th2细胞型免疫应答，促进Th1细胞型免疫应答可增强机体抗病毒和抗肿瘤效应[22－23]。

HIFU治疗肿瘤现已应用于多种实体肿瘤的临床治疗，除可杀灭肿瘤细胞、破坏肿瘤组织外，还可增加宿主抗肿瘤免疫功能。Rosberger等[24]发现，HIFU治疗外周血CD4＋/CD8＋比值低下的脉络膜黑色素瘤患者后，该比值升高并恢复正常。孔凡斌等[25]发现，HIFU治疗后宿主特异抗肿瘤免疫功能明显活化，宿主全身抗肿瘤免疫功能明显改善；HIFU可使一些生物活性物质如IFN－γ，IL－2，TNF－α等表达增高，从而改善肝癌患者体内Th1向Th2漂移的状态等[26]。

本研究结果显示，IMQ和HIFU联合治疗能够延长荷瘤小鼠的生存时间；能促进小鼠脾淋巴细胞对B16细胞的细胞毒作用，治疗后荷瘤鼠脾淋巴细胞与肿瘤共培养时，脾T淋巴细胞所分泌的IFN－γ水平和TNF－α水平均增高（即Th2向Th1逆转），其作用大于两种方法单独治疗时的免疫增强作用。因此，推测Th2向Th1逆转是可能是两种治疗方法联合后可抑制局部肿瘤的生长及延长小鼠生存时间的机制之一。

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