早卵泡期超长方案结合选择性单囊胚移植在体外受精中的应用

赵军招 应映芬

赵军招，医学博士，教授，主任医师，硕士研究生导师。温州市重点创新团队负责人，温州医科大学附属第二医院生殖中心主任。省“151”第三层次和市“551”第二层次人才。中国妇幼保健协会生育力保存委员会常务委员；省医学会计划生育与生殖医学分会第六届委员会临床学组副组长；省人口与健康学会生殖健康专业委员会副主任委员；山东大学学报医学版和温州医科大学学报审稿专家。以第一或通信作者发表论著40多篇。主持课题获省科技进步二等奖和省医药卫生创新一等奖。

自1978年第1例试管婴儿诞生以来，体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）已成为世界各国治疗不孕症的重要手段。IVF-ET治疗需要借助不同的促排卵方案。目前临床上常用的控制性超促排卵方案根据是否使用促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a） 分为GnRH-a降调节方案和非GnRH-a降调节方案。根据GnRH-a使用时间以及剂量将常见的GnRH-a降调节方案分为黄体期标准长方案、卵泡期长方案、超长方案、改良超长方案、口服避孕药后长方案以及短方案等。非GnRH-a降调节方案主要包括自然周期方案、微刺激方案、促性腺激素释放激素拮抗剂方案、黄体期促排卵方案、卵泡期高孕酮状态下的超促排卵方案等。为患者制定个体化的控制性超促排卵方案，以期获得高质量的卵子和优质胚胎，提高临床妊娠率和活产率，降低并发症的发生，是目前临床工作中需解决的关键问题。本文着重谈谈早卵泡期超长方案结合选择性单囊胚移植在体外受精中的应用。

1 早卵泡期超长方案的应用

IVF-ET治疗过程中最关键的步骤就是控制性超促排卵，它是指通过应用外源性促排卵药物诱发多个卵泡的发育和成熟。理想的控制性超促排卵方案应该是药物使用剂量低、获得卵子数目合理、卵子质量较高、超促排卵过程中及促排后内分泌环境及子宫内膜条件均适合胚胎的着床和发育、促排的周期取消率和不良反应如卵巢过度刺激综合征（ovarian hyper stimularion syndrome，OHSS）发生率低、可以精确地调控整个控制性超促排卵的过程。

1.1 早卵泡期超长方案在子宫内膜异位症患者中的应用 子宫内膜异位症是女性不孕患者的重要病因之一。在IVF-ET中，针对子宫内膜异位症合并不孕患者的治疗方案是以GnRH-a为主的超长降调节方案，但其治疗效果并不十分理想。超长降调节方案通过抑制黄体晚期内源性LH峰上升，促进卵泡发育的同步化，并且可通过提高子宫内膜容受性和降低盆腔中对胚胎产生毒性反应的细胞因子浓度，改善盆腔内环境而有利于胚胎的着床。但是超长降调节方案有一个很明显的不良反应，即2～3个月的垂体脱敏状态，使得卵巢功能压制过深。在多次GnRH-a针的降调节后再进行促性腺激素（Gonadotropin，Gn）超促排卵时发现卵巢功能压制较深，使得临床需要更大量的Gn启动量和Gn总量，甚至增加周期取消率，这在很大程度上增加了患者的时间以及经济成本。

Becchetti等[1]研究显示GnRH-a可增加子宫内膜胞饮突的数量，增强整合素的表达，从而提高子宫内膜容受性；同时可降低盆腔中对胚胎产生毒性反应的IL和TNF浓度，改善盆腔内环境，从而有利于胚胎的着床。改良超长方案可以明显提高子宫内膜异位症患者的临床妊娠率。改良超长方案因其在改善子宫内膜容受性及增加卵泡和内膜发育的同步性等方面的作用，日渐受到生殖一线临床医师的关注。

改良超长方案的使用方法也不尽相同：有口服避孕药一定时间后注射一定剂量的长效GnRH-a，有注射一次一定剂量的长效GnRH-a后再次注射一定剂量的长效GnRH-a，有上一周期的黄体中期进行一次全量长效GnRH-a等。这些方案与传统黄体期标准长方案相比，体现了改良超长方案在垂体脱敏状态的适宜程度和在内膜移植环境的优化。鉴于口服避孕药后注射GnRH-a或者2次注射GnRH-a仍然需要耗费患者较多的时间成本，本中心经过借鉴实践，通过患者来月经1～3d进行一次全量长效剂量GnRH-a 3.75mg的注射，32～38d后根据卵泡大小和血清中激素水平确定启动促排时间——这种卵泡期超长方案在达到适宜的垂体降调节状态的前提下，时间成本大大缩短，患者注射针剂次数大大减少，优化移植环境，最大程度缩短患者的达活产时间，从而最终提高患者的就诊效率和满意度。

Broekmans等[2]研究表明正常育龄妇女无论是在早卵泡期还是黄体中期单次注射长效GnRH-a 3.75mg后2周内源性激素可达完全抑制水平，3～4周后促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平逐渐恢复，7～8 周后雌激素（Estradiol，E2）水平开始上升，LH 水平的抑制作用可持续至给药8周。国内伍琼芳研究团队在早卵泡期超长方案的应用证实，在早卵泡期单次给予全量GnRH-a行垂体降调节，30d后随着体内FSH水平的逐渐恢复开始启动超促排卵，而LH的持续抑制作用可以避免内源性LH峰的产生[3]。本中心在早卵泡期超长方案的不断探索和推广应用的实践效果提示，早卵泡期超长方案给予一次全量长效GnRH-a 3.75m后的32～38d后，根据窦卵泡的苏醒情况以及性激素的水平，进行实时启动，并没有增加患者的Gn超促排卵的时间和用量，并且能够优化胚胎移植环境，提高患者的持续临床妊娠率和抱婴回家率。

1.2 早卵泡期超长方案在输卵管积水患者中的应用疗效 IVF-ET是主要针对输卵管疾病患者开展的助孕技术。据本中心统计，因输卵管因素接受IVF-ET助孕的妇女中，有20%存在B超下可视的输卵管积水。Johnson等[4]研究都证实了输卵管积水对助孕结局的负面影响，包括积水对胚胎的机械性冲刷、积水内的炎性介质对胚胎的毒性反应以及降低子宫内膜对胚胎的容受性等。有研究报道输卵管积水还可降低子宫内膜着床因子的水平；低渗、低K+、低乳酸、低蛋白溶液的积水对胚胎发育不利，会对IVF-ET的临床结局产生不同的影响[5-7]。

究其输卵管积水的实质，与上面提到的子宫内膜异位症其实是相类似的，都是产生一定的炎性介质影响试管婴儿结局。输卵管积水患者应用早卵泡期超长方案，可以让卵巢功能休息1个月左右时间，从而大大改善盆腔内环境，为新鲜胚胎的种植带来最小的炎性盆腔环境的干扰。当然，如果在降调节1个月左右患者进行启动后仍然在阴道B超下看到较为明显的输卵管积水，可予以适当抗生素预防；在超促排卵启动前或取卵日进行输卵管积水的超声引导下穿刺。实践提示早卵泡期超长方案同样适用于输卵管积水患者，并且可以取得理想的IVF-ET结局。

1.3 早卵泡期超长方案在卵巢储备功能低下患者的应用 近年来接受IVF-ET治疗的高龄妇女逐渐增加，38岁以上者占到30%以上。高龄患者的卵巢储备功能下降尤为明显，少部分年轻患者也存在卵巢储备功能下降的现象。即使进行试管婴儿助孕，这些患者的成功率也并不高。针对卵巢储备功能下降，临床医师更多倾向选择微刺激方案、短方案、超短方案、自然周期等方案。微刺激方案由于没有垂体降调节过程，很容易出现早发的LH峰，提前排卵取不到卵的情况时有发生，这给患者带来极大的精神压力。自然周期虽然是通过卵泡自然生长规律监测，但是取卵时间不容易掌控。

那么，如何改善卵巢储备功能低下妇女的助孕结局呢？首先，正确评估高龄妇女的卵巢储备功能，选择合适的促排卵方案，获得一定数量的卵子是实施IVFET治疗的必要前提。对于高龄患者，特别是40岁以上的患者，目前临床上还没有一种理想的超促排卵方案。罗克莉等[8]认为卵巢储备功能低下患者采用改良超长方案可以取得较好的临床结局。改良超长方案经过GnRH-a的预处理，使患者充分降调节，扳机日可以获得良好的LH、孕酮、E2值及内膜厚度，从而提高子宫内膜容受性[9]。

本中心通过早卵泡期超长方案的应用，38～42岁的双侧卵巢窦卵泡数在5个以上的患者临床妊娠率高达45%；36岁及以下卵巢储备功能下降的患者临床妊娠率达到60%。说明早卵泡期超长方案同样适用于卵巢功能下降患者，并且临床结局甚佳。

1.4 早卵泡期超长方案在多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者中的应用 PCOS是一种生殖内分泌紊乱疾病，这一特殊人群采用何种促排卵方案一直存在争议，国内大多数生殖中心采用的是传统长效长方案，认为该方案有助于PCOS患者获得较高质量的卵子和提高助孕成功率。另外，也有在长效长方案之前给予PCOS患者口服避孕药数个月的预处理，目的在于纠正此类患者LH/FSH比列异常、高雄激素血症等病理情况[10]。国外生殖中心大多选择拮抗剂方案，因其可以有效降低卵巢过度刺激风险的发生。

早卵泡期超长方案在应用全量长效GnRH-a后，无需进行传统长方案之前的口服避孕药的预处理，通过单次全量长效GnRH-a的注射，使得卵巢功能充分休息，对于LH/FSH比列异常升高的患者也可以在降调节1个月左右的时间后达到理想的垂体脱敏状态，更好地控制了患者Gn启动前LH水平。此外，通过垂体充分降调节，更好地控制了扳机日孕酮水平及孕酮/E2水平，改善了内膜的容受性。Orvieto等[11]研究显示扳机日A、B型子宫内膜更易于胚胎的着床和发育，而C型子宫内膜的着床率明显降低；改良超长方案患者扳机日A、B型子宫内膜形态更高。

本中心在PCOS患者应用早卵泡期超长方案后，同样使得新鲜胚胎移植的子宫内膜环境改善，增加了胚胎的着床率，提高了此类患者的成功率。

2 选择性单囊胚移植的推进

辅助生殖技术在国内成功应用30年，IVF-ET妊娠率在逐年上升，甚至一些大型生殖中心的成功率达到国际先进水平。成功率不断提升的同时，笔者也将更多的关注点投向IVF-ET的安全性。IVF-ET的终极目标是采用尽量少的时间和经济成本使患者获得单个健康活婴的出生。传统的移植策略往往导致多胎妊娠及OHSS等并发症发生率居高不下，致使孕产妇、胎儿相关并发症（妊娠期高血压、早产、低体重新生儿等）不断出现。随着囊胚培养技术的不断提高，越来越多的研究发现囊胚移植可以达到更高的胚胎种植率，尤其是选择性单囊胚移植策略可以提高患者的累积妊娠率，显著降低多胎妊娠率，有效降低中重度OHSS的发生率以及异位妊娠率，由此选择性单囊胚移植的理念应运而生[12-13]。Mullin等[14]研究表明，选择性单囊胚移植与双囊胚移植比较并没有降低每个取卵周期的累积妊娠率，但能避免多胎的发生，显著减少辅助生殖治疗的多胎妊娠率。

在常规IVF-ET治疗中，一般在胚胎受精后第2天或第3天移植。目前评价早期胚胎的形态学标准仍然存在着较多的主观因素，对胚胎的后期发育潜力难以作出准确的判断。随着囊胚体外培养技术的提升，许多研究发现早期胚胎的种植率和临床妊娠率并没有囊胚的高[15-17]，因为早期胚胎对内膜种植窗的要求高，无论是新鲜周期还是冷冻周期，都需要子宫内膜和早期胚胎高度的同步化才能收获好的临床结局。但是IVF-ET由于各种超促排卵方案的不同，尤其是促排后期随着卵泡进一步走向成熟，体内E2水平的上升，LH和孕酮水平很多时候也出现了提早升高，使得胚胎种植窗提前打开，如果仍然选择移植早期胚胎往往使得内膜和胚胎不同步而导致胚胎种植失败，降低胚胎的种植率，而囊胚的种植率则不受影响[18]。

早期胚胎从四细胞、八细胞发育至囊胚期具有阻滞现象，逾越八细胞期的发育阻滞就成为了具有生命力的胚胎。只有具备良好发育潜能的早期胚胎才能发育到囊胚期[19]。所以早期胚胎在体外培养至囊胚的过程中，将会自然淘汰发育潜能差的胚胎，那些生存能力强、质量好的胚胎，具有更大发育潜能的胚胎经过优胜劣汰的大自然法则而存留下来。囊胚移植时子宫腔内pH值较输卵管内低，囊胚对酸度的适应能力较早期胚胎好，可以提高囊胚的存活率；囊胚与子宫内膜同步性更好，更符合生殖生理状态，因子宫的收缩而排出体外的风险降低，增加囊胚种植率。

虽然选择性单囊胚移植具有显著的优点，但是并未在国内广泛应用开展。究其原因，和患者的接受度、IVF-ET的经济负担、囊胚体外培养时间增加影响胚胎安全性等因素有关，仍然需要做出更多相关努力。

3 早卵泡期超长方案结合选择性单囊胚移植

GnRH-a除可通过垂体水平发挥其降调节作用外，还可直接与卵巢颗粒细胞的特异位点结合，抑制卵巢内E2和睾酮等类固醇激素的分泌，降低其在卵泡液中的水平。Botero-Ruiz等[20]研究显示卵母细胞的成熟与受精能力与卵泡液内的E2及睾酮水平呈负相关。早卵泡期超长降调节方案可以通过改善卵泡发育同步性及调节卵泡液中与卵子发育及受精潜能高相关的类固醇激素和细胞因子的分泌来改善卵子的质量。上述利好因素之下，早卵泡期超长方案联合选择性单囊胚移植周期临床妊娠率较传统的黄体期长方案明显升高，本中心的数据也证实了这点。

垂体在全量长效GnRH-a 3.75mg降调节后可以有效维持垂体脱敏状态至降调节后8周，这段时间内需要寻找最佳的启动时间，言外之意需要准确判断卵巢内小窦卵泡苏醒情况。如果大部分卵泡在降调节30+d后回访进行卵泡监测提示双侧卵泡细小，即双侧卵巢内小窦卵泡的直径在3mm以内时，笔者认为此时启动需要耗费额外的Gn，同时体内E2水平未达到30pg/ml，更加证明小窦卵泡还没有完全苏醒，需要适当推迟启动时机；如果全量长效GnRH-a 1月余后双侧卵巢内已经有一批小窦卵泡的直径达到5mm，体内E2水平达到30pg/ml时，说明小窦卵泡即将苏醒，此时也正是很好的启动时机。

总体来讲，早卵泡期超长方案选择全量长效GnRH-a后32～38d评估患者的垂体脱敏状态并进行适时启动，并没有显示Gn剂量和Gn时间较传统的黄体期长方案显著增加，并不会显著增加患者的时间和经济成本。随着细胞培养技术日益进步，囊胚移植周期比例在不断增加，本中心已经成熟开展了“全胚养囊”策略，较高的囊胚形成比率、可利用囊胚比率以及优质囊胚比率极大地改善了患者的临床妊娠结局，最大限度地缩短了患者的治疗周期，实现了患者尽快抱婴回家的愿望。选择性单囊胚移植在保证临床妊娠率的同时，明显降低了多胎率、晚期流产率、早产率及低体重儿出生率等不良妊娠结局的发生；可作为一种优先考虑的临床移植策略，结合早卵泡期超长方案对胚胎移植环境的改善，两者的结合体现出了较高的性价比。

综上所述，早卵泡期超长方案不仅仅可以在子宫内膜异位症、输卵管积水、卵巢储备功能低下、PCOS等患者中有其用武之地，而且临床结局令人鼓舞。早卵泡期超长方案联合选择性单囊胚移植是一种非常值得推广应用的试管婴儿助孕方案，值得进一步大规模前瞻性临床研究进一步证实。

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