锁阳通过抑制炎症因子的表达对抗CCL4导致的小鼠肝纤维化*

黄小梅，郭莉娜，李 灿，李荣华，李卉园，孔德华，胡康安， 林友胜，邓峰美△，王航宇，刘漪沦

1.成都医学院 基础医学院(成都 610500)； 2.新疆石河子大学 药学院(石河子 832000)；3.成都医学院第一附属医院(成都 610500)

慢性肝脏疾病、肝细胞损伤和炎症等刺激造成肝星状细胞(HSC)激活，活化的HSC转化成为肌成纤维细胞，产生大量的细胞外基质(ECM)，过度的ECM累积形成肝纤维化[1]。肝纤维化未得到及时适宜的治疗，可发展为肝硬化或肝癌。有文献[2]报道，肝纤维化的发生具有可逆性，在恰当时间给予治疗，可以缓解甚至是逆转肝纤维化。

目前，对肝纤维化的治疗中，中药抗肝纤维化逐步进入人们视野。很多中药开始运用于治疗慢性肝脏疾病[3-4]。但是中药对肝纤维化的治疗中没有系统研究，缺乏临床验证，因此，中药的开发和利用有利于为肝纤维化的治疗提供新药物。

锁阳作为一种重要的中药材，对润肠通便、补肾阳、益精血有功效，并在防癌、抗癌、抗疲劳以及抗炎、抗氧化、抗衰老、滋补强壮、增强免疫功能也具有重要医疗价值[5]。在肝纤维化形成过程中，活化的HSC转化成为肌成纤维细胞，从而产生ECM是肝纤维化形成的主要机制[6]; 而肝纤维化形成过程中各种炎症因子的表达，如TGF-β1、TNF-α、IL-1等[7-8],进一步促进ECM的产生，从而加重肝纤维化。前期课题组在大鼠实验[9]中发现，锁阳具有抗肝纤维化的作用，推测锁阳是否通过其抗炎作用减弱肝纤维化的形成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 购买6周龄、雄性、SPF级别、18～22 g的C57BL/6J小鼠50只，购自成都达硕公司，实验动物生产许可证：SCXK(川)2013-024。饲养温度为20 ℃左右，相对湿度为35%～40%，饲养的饲料为常规饲料，自由饮水。

1.1.2 实验药物与试剂 药物由新疆石河子大学药学院王航宇教授提供。秋水仙碱(购自云南玉药生物制药有限公司)；CCl4(购自成都科龙化工试剂厂)；ALT、AST、TGF-β1 、TNF-α、IL-1试剂盒 (购自南京建成试剂公司)等。

1.1.3 仪器 组织包埋机(EG1150H)购自LEICA；组织切片机(RM2016)购自LEICA；生物显微镜(CX21FS1C) 购自奥林巴斯工业有限公司；Roche Modular D2400 生化分析仪购自瑞士 Roche 公司等。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组、造模、给药 将50只6周龄的小鼠随机分为5组，每组10只，即正常组、CCL4模型组、秋水仙碱组(实验剂量为0.1 mg/kg)和锁阳低、高剂量组(实验剂量为2.77 mg/kg、27.7 mg/kg)；从实验开始的第1周，正常组给予橄榄油灌胃，按4 μL/g剂量腹腔注射，2次/周；其余4个组，给予橄榄油和CCL4按1∶3比例，4 mL/kg剂量腹腔注射，2次/周，直到第4周，复制肝纤维化模型；同时，从第5周开始，秋水仙碱组、锁阳低剂量和锁阳高剂量组分别给予相应的药，1次/d，灌胃，持续至第6周。

1.2.2 指标测定 用试剂盒检测血清中ALT、AST的活性，酶联免疫法检测血清中TGF-β1、TNF-α、IL-1的含量。

1.2.3 组织病理学检测 取肝脏组织进行福尔马林固定，石蜡包埋，切片，进行Masson染色，观察肝脏纤维的变化。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 肝脏指数的比较

为观察锁阳对小鼠体质量和肝脏质量的影响，本实验采用肝脏指数(肝脏体质量/小鼠体质量)进行比较，肝脏受到损伤越重肝脏指数越高。相比正常组小鼠肝脏指数，模型组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。秋水仙碱和锁阳低、高剂量组小鼠的肝脏指数相比模型组降低，差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。

图1 各组肝脏指数注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

2.2 肝功能检测

与正常组比较，模型组小鼠的AST、ALT明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，秋水仙碱和锁阳高剂量组的AST、ALT均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；锁阳低剂量组的AST、ALT均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但其降低的效果没有锁阳高剂量组明显(表1)。

2.3 肝脏血清中炎症因子TGF-β1、TNF-α、IL-1检测

模型组小鼠的TGF-β1、TNF-α、IL-1的浓度比正常组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，秋水仙碱和锁阳低、高剂量组的TGF-β1、TNF-α、IL-1均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

表1 各组ALT、AST比较

注：与正常组比较，*P<0.05、**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05、##P<0.01

图2 肝脏血清中炎症因子的检测

注：A：各组TGF-β1检测结果;B：各组TNF-α的检测结果;C：各组IL-1的检测结果；与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.4 肝脏组织病理学的变化

通过上述实验，进一步研究锁阳对肝脏组织病理学变化的影响。实验中通过Masson染色进行观察，相比正常组，模型组的小鼠肝脏组织中有明汇管区纤维组织增生，纤维化明显;而给药的3个组中，小鼠肝脏组织有不同程度的好转；锁阳高剂量组与秋水仙碱组部分组织纤维化减轻；其中，锁阳低剂量组与锁阳高剂量组相比，组织情况略差。通过肝脏组织的病理学观察发现，锁阳可减弱CCL4诱导的肝脏组织病理学恶化(图3)。

图3 肝脏组织病理学的变化(×100)注：A：正常组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：锁阳低剂量组；E：锁阳高剂量组

2.5 Image J分析肝纤维化的面积

通过Image J软件处理，统计纤维化的面积，从而进一步观察锁阳抗纤维化的效果。模型组小鼠肝纤维化面积比正常组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组小鼠比较，秋水仙碱组和锁阳低、高组的肝纤维化面积明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)(图4)。

图4 各组小鼠肝纤维化面积注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

3 讨论

在慢性肝脏损伤和肝纤维化的动物实验[10]中，最经典的模型制造是用CCL4诱导肝纤维化，因此，本实验中采用CCL4诱导造成肝脏的损伤。在CCL4诱导的肝纤维化造模成功后，采用不同浓度的锁阳作用于小鼠治疗肝纤维化，主要是按前期大鼠用药的剂量，根据大小鼠体表面积的比对来用药[9]，将其分为锁阳低剂量组(2.77 mg/kg)和锁阳高剂量组(27.7 mg/kg)。本研究中发现，用药小鼠的精神状态、活跃程度都有所改善。模型组小鼠ALT、AST值比正常组明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；秋水仙碱组和锁阳低、高剂量组的ALT、AST的值比模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。通过Masson染色可以看到锁阳可以减弱纤维的增生和胶原的产生。且秋水仙碱和锁阳高剂量组相比模型组，其纤维化减少的更明显。这些说明锁阳具有抗肝纤维化作用，且对锁阳低剂量和高剂量组之间进行比较，发现锁阳高剂量组的抗肝纤维化的作用改善更明显，这说明锁阳在抗肝纤维化的治疗中，可能具有剂量依赖性。

炎症与肝纤维化的形成密切相关[7]。TGF-β1作为经典的炎症因子，在纤维化形成中占有重要作用，它可以促进HSC转化为肌成纤维样细胞，产生大量的ECM[11]。TGF-β1一方面可以通过促进下游的SMAD3过度激活，从而促进HSC的活化[12]；另一方面，TGF-β1还可以过度激活NOX4，从而激活HSC[13],进一步加重肝纤维化的形成。炎症反应中，巨噬细胞通过产生TNF-α、IL-1,促进了HSC的激活，从而形成肝纤维化[14]；同时，活化的HSC自身又可以产生这些因子，从而加重炎症反应[15]。实验中，相比正常组，模型组的TGF-β1、TNF-α、IL-1升高，而用锁阳治疗后，TGF-β1、TNF-α、IL-1降低，对应的小鼠肝纤维化的面积也减少；这说明锁阳通过抑制TGF-β1、TNF-α、IL-1的表达而减弱了肝纤维化的形成，但其机制还有待进一步研究。

锁阳为中药化合物，主要由有机酸、三萜、多糖、甾族化合物和类黄酮组成[16]，其成分比较复杂，在动物实验中表现出具有保肝的作用[17]，但是具体是锁阳中哪种成分起到主要作用，还有待进一步研究。本课题组通过活性追踪发现，锁阳中一种活性最强的新化合物-Songarin A，它具有笼状碳苷结构，对下一步深层次研究锁阳对肝纤维化的作用提供线索。

综上所述，锁阳对CCL4诱导的小鼠肝纤维化模型中具有保护肝脏作用，它能够降低肝脏中炎症因子TGF-β1、TNF-α、IL-1的表达，避免了肝脏受到炎症因子的刺激，从而减轻了肝纤维化，起到了保护肝脏的效果。但是其主要发挥作用的成分以及其抗肝纤维化的具体机制目前还有待进一步研究。

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