外源性α1-抗胰蛋白酶对非小细胞肺癌转移与侵袭的促进作用研究*

杨 敏，李 奕，吴东明，刘 腾，刘明全，许 颖△

1.成都医学院第一附属医院 检验科(成都 610500)；2.成都医学院(成都 610500)

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一，其生存率较低[1-2]，且绝大多数肺癌为恶性上皮性肿瘤。根据癌细胞在显微镜下组织学上的大小和外观，肺癌主要分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC约占肺癌病例总数的85%。肿瘤细胞具有扩散、转移、复发和耐药等特性，转移性肺癌细胞还具有抗辐射和化疗的特点均导致NSCLC患者预后较差[3]。因此，发掘新的治疗方法对于NSCLC的治疗显得尤为重要。

α1-抗胰蛋白酶(A1AT)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一员，是由内胚层上皮细胞产生和分泌的一种糖蛋白。A1AT在肝脏疾病、血管炎、肺气肿及其他肺部疾病中起着重要的作用[4-9]。当机体发生恶性肿瘤时，血清中A1AT明显增高[10]，其主要原因是由于恶性肿瘤具有很强的糖蛋白合成功能，能合成大量的A1AT；同时被肿瘤破坏的正常组织也将其内部的A1AT释放入血。近来有研究[11]表明，突变型P53能够上调A1AT的表达，导致肺癌的发生发展,且与肺癌的不良预后有关。另有研究[12]表明，醌氧化还原酶(NQO1)可以结合A1AT mRNA的3'非翻译区(UTR)和编码区(CR),增强A1AT mRNA的翻译，导致肿瘤患者的血清A1AT质量浓度升高。此外，Frenzel 等[13]研究发现，A1AT能够促进血管生成素样蛋白4的表达，增强肿瘤的血管生成能力。由此可见，体内增高的A1AT会影响肿瘤患者的预后。

上皮间质转化(EMT)是肿瘤发生转移的主要过程之一。在正常组织中，EMT与正常器官的发育与形成、组织的重塑和伤口的愈合有关[14]。EMT在肿瘤中的作用是基于间质标志物的富集(如N-cadherin、Vimentin)和上皮细胞标志物的减少(如E-cadherin)[15-16]。本研究通过检测EMT相关指标以探讨A1AT在NSCLC转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌A549细胞为本课题组保存。A1AT(Cat.No.16382,Proteintech)和β-actin抗体(Cat.No.60008, Proteintech)用于免疫印迹法；E-cadherin(Cat.No.32A8, Cell Signaling)，N-cadherin(Cat.No.22018, Proteintech)，Vimentin(Cat.No.10366, Proteintech)用于免疫印迹法和免疫荧光技术。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Cat.No.511103)和山羊抗兔IgG(Cat.No.511203)购自成都Zen BioScience公司。Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(Cat.No.SA00009-1)、山羊抗兔IgG(Cat.No.SA00009-2)和人重组A1AT蛋白(Cat.No.Ag9516)购自美国Proteintech公司。本实验所用细胞培养皿、6孔板、24孔板、8 μM transwell小室均购自美国Corning公司。ECL显影液和PVDF膜购于美国Mlllipore公司，化学发光成像仪购于美国BIO-RAD公司。荧光显微镜DM4000B 购于德国莱卡公司。RPMI-1640培养基、0.25%胰酶购于美国hyclone公司，胎牛血清购于美国cell max公司，青-链霉素购于美国Gbico公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞用含有100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的链霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，待细胞密度达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，取对数期生长细胞进行试验。

1.2.2 免疫荧光技术 将1 cm直径的无菌盖玻片置于24 孔板中，接种A549细胞5 ×104个。分别加入终质量浓度为0、600、1 200、2 400 ng/mL 的A1AT，培养24 h。去除培养基，用预冷PBS 洗3次，4%多聚甲醛室温固定细胞。PBS 洗 3 min × 3 次。0.5%的 triton X-100 通透，PBS洗3 min ×3次。用5%山羊血清室温封闭30 min，分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin(1∶200)孵育，4 ℃过夜。PBS洗3 min × 3 次，cy3标记的荧光二抗(1∶500 )，37 ℃避光孵育2 h。PBS洗3 min ×3 次，加DAPI染核5 min，PBS洗 3 min ×3 次，用50%甘油封闭。荧光正置显微镜下观察并拍照。实验重复3 次。

1.2.3 免疫印迹法 不同质量浓度的A1AT处理A549细胞24 h后，用RIPA裂解细胞，BCA试剂盒(购自上海碧云天)检测蛋白质量浓度(要求R2>0.99)，取50 μg蛋白，加入5 × loading buffer处理，煮沸10 min，用12%的SDS page胶跑电泳(浓缩胶80 V，分离胶100 V)，0.22 μM的PVDF膜100转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃过夜。TBST洗3 min × 3 次，HRP标记二抗(1∶10 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗3 min × 3 次，用化学发光成像系统进行拍照，实验重复3 次。

1.2.4 transwell实验 准确计数2 × 104个细胞，加入含有200 μL无胎牛血清培养基的transwell小室(8 μM)，24孔板孔中加入含有10%胎牛血清的培养基600 μL(transwell小室和24孔板孔中的培养基中都含有相同质量浓度的A1AT)，将transwell小室置于24孔板孔中，培养24 h。取出小室，PBS洗3次，用甲醇配置的1%结晶紫染色20 min，PBS洗3次，用棉签轻轻擦去上层细胞，取下底膜，用中性树胶封闭，显微镜下计数9个视野，取平均值，检测细胞的转移能力。对细胞侵袭能力的检测:matrigel 4 ℃解冻，按无血清培养基∶matrigel=7∶1比例混匀作为胶层，每小室加入50 μL，37 ℃放置1 h待胶凝固，按转移能力的步骤进行后续实验。

1.2.5 划痕试验 向6孔板中加入10 × 104个细胞，培养24 h，用枪头垂直6孔板划横线，PBS洗3次，加入含有不同浓度A1AT的无血清培养基，继续培养24 h，按0、24 h的顺序拍照。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 外源性A1AT促进A549细胞的转移和侵袭

为了证实加入A1AT后细胞是否发生了转移和侵袭的现象，本研究进行了transwell实验和划痕试验。在加入不同质量浓度的A1AT后，细胞的转移能力随着A1AT质量浓度的增高明显增强(图1A，图1B)，侵袭能力也随着A1AT质量浓度的增高明显增强(图1C,图1D)。细胞划痕试验同样证实了以上结果(图1E,图1F)。

图1 外源性A1AT促进A549细胞的转移和侵袭

注：A-B：transwell分析检测不同A1AT(ng/mL)质量浓度下细胞的转移能力(P<0.01)；C-D：matrigel transwell分析检测不同A1AT(ng/mL)质量浓度下细胞的侵袭能力(P<0.01)；E-F：划痕试验检测不同A1AT(ng/mL)质量浓度下细胞的转移能力(P<0.01)

2.2 外源性A1AT对上皮间质转化标志物的影响

用不同质量浓度的A1AT处理细胞24 h后，通过免疫印迹法检测EMT标志物的变化情况，结果显示：随着A1AT质量浓度的增高,上皮标志物E-cadherin表达量明显降低，间质标志物N-cadherin和Vimentin表达量明显升高(图2A)。细胞免疫荧光实验(图2B)同样证实了这一结果。

图2外源性A1AT对上皮间质转化标志物的影响

注：A：免疫印迹法检测外源性A1AT(ng/mL)处理后，EMT标志物的表达情况；B：免疫荧光技术检测外源性A1AT(ng/mL)处理后，EMT标志物的表达情况

3 讨论

肺癌是人类癌症相关死亡的主要原因之一，每年有数以百万计的新增病例[17]。目前治疗方式虽然在外科手术治疗、化疗和放疗方面取得了新进展，但肿瘤转移仍然是预后不良的主要原因。因此，寻找新的肿瘤转移相关基因并研究其促进新癌发生的机制非常重要。A1AT是人类血清中最丰富的蛋白酶抑制因子，在恶性肿瘤发生时明显增高。血浆中的A1AT主要由肝脏产生，单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞和部分肿瘤细胞也可合成，这些肝外合成的A1AT在局部组织损伤的调节中起着重要作用[18-19]。很多研究[20-21]表明A1AT在各种癌症，如肺癌、前列腺癌和乳腺癌中水平会增加，但是在一些良性肺病(如COPD、肺部炎症等)水平也会升高。Pérez-Holanda等[22]研究(267例结直肠癌患者+327例健康对照组)也表明，结肠癌患者组的A1AT水平显著高于对照组。综上所述，A1AT在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。

研究[23-25]表明，EMT在肿瘤的转移与侵袭中发挥了重要作用。肿瘤细胞是否转移直接影响肺癌患者的生存率，而EMT是癌细胞转移起始过程关键步骤之一，因此我们通过检测EMT标志物来探讨A1AT对肺癌细胞的影响。EMT与间质标志物的增加(如N-cadherin、Vimentin)和上皮标志物(如E-cadherin)的减少有关[26-29]。本研究免疫印迹法结果显示，随着A1AT质量浓度的增高，E-cadherin的表达量明显降低，N-cadherin、Vimentin含量明显增高，表明随着A1AT质量浓度的增加，细胞发生了明显的EMT。免疫荧光技术同样证实了这一结论。肿瘤的转移途径包括细胞粘附分子的损失、转移和侵袭能力的增强、进入血管、溢出、定值[30]。本研究的transwell实验和划痕试验显示，随着A1AT质量浓度的增高，细胞的转移和侵袭能力明显增强，表明A1AT能够增强细胞的转移和侵袭能力。

综上所述，外源性A1AT能够增强NSCLC的转移与侵袭。因此，靶向阻断NSCLC患者A1AT合成与分泌具有潜在的治疗作用。

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