内皮抑素衍化30肽对HepG2细胞增殖活性和迁移能力的影响

于佳琪 ，赵航 ，杨扬 ，魏欣鹏 ，牛淑冬 ，李淑艳

1.齐齐哈尔医学院2014级临床专业，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院2015级临床专业，黑龙江齐齐哈尔 161006；

3.齐齐哈尔医学院生理学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；4.齐齐哈尔医学院生物化学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006

尽管在控制风险因素和监测方面有所改善，肝细胞癌仍然是世界癌症死亡的原因之一[1]，该病是临床上常见的恶性肿瘤，造成肝癌患者死亡的主要原因是局部复发和远处转移。外科手术、射频消融RFA、介入治疗等综合治疗的方案，目前仍旧无法取得理想的远期疗效，有观点认为：生物治疗在在该病治疗中具有巨大的潜力[2]，而新型的蛋白质多肽有望成为高效、低毒的抗肝癌药物。

2005年，Robert M等[3]发现内皮抑素N末端锌结合结构域的27个氨基酸负责其抗肿瘤活性。2007年哈尔滨医科大学刘兴汉教授课题组在对人类内皮抑素基因进行改造并人工合成、表达人内皮抑素30肽，该多肽是将内皮抑素25～31位RGIRGAD序列改为RGDRGD[4]。

该研究将人肝癌HepG2细胞作为实验材料，研究30肽对其增殖和迁移能力的影响，为该多肽用于肝癌的临床治疗提供一定的实验基础和思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HepG2细胞株为本课题组冻存，RPMI1640培养基为Gibco公司产品、胎牛血清、胰酶均为美国Invitrogen公司产品，基质胶、Sephadex G-15 medium为sigma公司产品，WST-1试剂盒购自罗氏 （瑞士）公司，几丁质亲和层析树脂购自NEB公司，Transwell小室为Corning Costar公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 30肽的提取和纯化 参考王淑静的纯化方法[5]，分别从构建的30肽基因工程菌中提取纯化30肽，经葡聚糖凝胶G15层析去除DTT。通过Tricine-SDSPAGE鉴定其纯度。

1.2.2 细胞增殖实验 将肝癌HepG2细胞1×103个/孔加入96孔培养板中，常规培养24 h，各孔中分别加入浓度为 0、20、40、60、80 μg/mL 和 100 μg/mL 的 30肽，每个浓度5个复孔，同时设立对照组，继续培养24 h和48 h后将孔板中培养基吸去，PBS冲洗后加入无血清培养基100 μL+10 μLWST-1，常规培养1 h，分别以450 nm为测定波长，630 nm为参考波长用酶标仪测定、记录各孔吸光度值。

1.2.3 30肽对HepG2细胞迁移能力的影响 通过Transwell侵袭实验检测30肽对HepG2细胞迁移能力的影响。参考Liu等[6]方法，以5 μg纤粘蛋白涂于Transwell小室聚碳酸酯膜外表面，置超净台内风干，5 μg基质胶涂于小室内表面，干燥，形成基质屏障层。用终浓度为50 μg/mL的30肽分别处理HepG2细胞0、12、24 h和48 h。用胰酶消化细胞，用无血清1640培养液重悬，将细胞浓度调整1×105个/mL，取细胞悬液100 μL加至Transwell小室中，在小室外培养板内加入500 μL含20%血清的培养基，置37℃，5%CO2培养箱内孵育24 h后，吸弃小室中的培养基，用棉签拭去小室内侧壁未转膜的细胞，用0.1%结晶紫染色0.5 h，晾干，显微镜下进行穿膜细胞计数，拍照保存，每膜计上下左右中5个不同视野的穿膜细胞数量，计算平均值，每组设3个平行孔。

1.3 统计方法

采用SPSS 19.0统计学软件分析数据，计量资料（±s）进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内皮抑素衍化30肽的表达及纯化

重组30肽经几丁质亲和层析后，葡聚糖凝胶G15 除 DTT，分别取 5 μg 和 2 μg 进行 Tricine-SDSPAGE小肽电泳，结果如图1中所显示，特异条带分子量在3kDa左右出现，与目标条带分子量预期相符。

图1 纯化内皮抑素衍化30肽的Tris-Tricine-SDS-PAGE鉴定[M.分子量 marker；A.30 肽（5 μg）；B.30 肽（2 μg）]

2.2 30肽对HepG2细胞增殖能力的影响

分别取浓度分别为 0，20，40，60，80，100 μg/mL的30肽作用HepG2细胞24 h和48 h，随着剂量和作用时间的增加，细胞的活性明显被抑制，30肽对HepG2细胞增殖能力的抑制作用呈时间-剂量依赖性。应用线性回归分析计算出30肽对HepG2细胞生长半数抑制浓度为 49.7 μg/mL(IC50=49.7 μg/mL)。结果见图2。

图2 30肽对HepG2细胞增殖的抑制作用

2.3 30肽对HepG2细胞迁移能力的影响

用终浓度为50 μg/mL的30肽分别处理HepG2细胞0、12、24 h和48 h。 通过体外Transwell侵袭实验检测30肽对HepG2细胞迁移能力的影响，从图3A可见，4组细胞的穿膜细胞数分别是（205.5±4.5）、（132.6±3.0）、（71.3±2.6）、（48.6±5.1），30 肽明显抑制HepG2细胞的迁移能力，随着作用时间的延长抑制迁移能力明显增加（图3B）。

图3 30肽对HepG2细胞迁移能力的影响[＊P＜0.05，与 30 肽 0 h 组比较]

3 讨论

肝癌是全球癌症相关死亡率最常见的原因之一，在中国尤其如此[7]，侵袭和转移在该病发生发展过程中起重要作用，也是肿瘤与正常细胞的主要区别,肝癌细胞具有较强的侵袭和转移能力是致使外科手术及放、化疗等综合治疗手段疗效差和该病死亡率、复发率高的最主要原因，此外肿瘤的生长与血管生成等因素密切相关，寻找和开发有效、安全的阻断抑制肿瘤细胞生长增殖和转移的靶向药物，一直是研究的热点问题。

胶原蛋白XVIII由十个胶原结构域构成，内皮抑素位于第一非胶原结构域区，由三聚结构、内皮素结构域和铰链区组成，其中铰链区位于N-末端的三聚结构和C-末端的内皮抑素结构域之间。1997年，O′Reilly等[1]证实内皮素具有特异性地抑制血管内皮增殖并有效地抑制血管生成和肿瘤生长的作用，分子量为20 kDa，是血管生成和肿瘤生长的内源性抑制剂将其命名为Endostatin，而在随后的研究中证实，Endostatin是胶原蛋白XVIII的C-末端片段，其衍生肽与整联蛋白相互作用并调节肌动蛋白细胞骨架和内皮细胞的迁移并描述了在内皮抑素内具有整合素结合序列[8]，此外研究其发现其具有抑制肿瘤细胞生长、改善非纤维化等作用[9-10]，已作为一种抗肿瘤药物用于临床，但内皮抑素分子量较大、有不良反应是其临床应用中的不足之处和有待突破的瓶颈问题，如何在不影响其抑制肿瘤活性的前提下，尝试减小其分子量、对其结构进行修饰是其对其研究的方向。

N-末端的27个氨基酸是内皮抑素的活性区域，30肽是人工对27肽进行结构修饰的产物，后者即有内皮抑素的活性区，又具有有RGDRGD序列。串联的RGD与新生血管内皮细胞膜上αⅤβ3整合素结合，抑制内皮细胞生长，还与大多数肿瘤细胞膜上α5β1整合素结合，抑制肿瘤细胞生长与转移[11]。

该实验采用了WST-1试剂盒检测细胞存活和生长活性，WST-1是MTT的一种升级替代产品，与MTT相比具有实验结果更加稳定、线性范围更宽、灵敏度更高等优点，故实验结果更加精确可信。实验中选择了人肝癌HepG2细胞为实验材料，分别将20、40、60、80 μg/mL 和 100 μg/mL30 肽加入培养基中，培养24 h和48 h后，可见HepG2细胞的增殖活性降低，其抑制作用与培养时间和30肽剂量增加而增强，即具有时间-剂量依赖性。统计分析计算结果显示，30肽对HepG2细胞生长半数抑制浓度为49.7 μg/mL。

通过Transwell侵袭实验检测30肽对HepG2细胞迁移能力的影响，使用Matrigel等基质成分模拟体内基底膜，肿瘤细胞穿越Matrigel和聚碳酸酯膜也需要完成粘附、基质降解及运动等多个环节[12]，用50 μg/mL 的 30 肽分别处理 HepG2 细胞 0、12、24 h和48 h后，4组细胞的穿膜细胞数分别是 （205.5±4.5）、（132.6±3.0）、（71.3±2.6）、（48.6±5.1），结果可见，30肽明显抑制HepG2细胞的迁移能力，随着作用时间的延长抑制细胞迁移的能力明显增加。

综上所述，RGD修饰的30肽不仅具有抑制肿瘤细胞的生长和增殖活性，还对肿瘤细胞的迁移、转移有抑制作用，从而产生肿瘤转移能力下降效应，但是，30肽发挥其抑制HepG2细胞的侵袭、转移行为的具体机制如何，今后我们课题研究的目标。

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