小分子热休克蛋白Hsp16.3参与介导结核分枝杆菌致巨噬细胞凋亡的研究进展

黄丹丹

川北医学院基础医学院，四川南充 637007

结核病是世界范围内亟待解决的问题之一[1]。虽然目前联合药物治疗对结核病的蔓延有一定抑制作用，但结核病仍然是全球造成死亡的十大疾病之一。相关学者通过对感染结核分枝杆菌（MTB）的肺巨噬细胞进行蛋白质组学分析，发现在235种蛋白质中，绝大多数异常表达的蛋白质都参与细胞凋亡、氧化磷酸化等生物学过程，证实了细胞凋亡在结核病的发生发展过程中扮演了重要的角色[2]。但另一方面，大量研究表明，MTB感染巨噬细胞后，可延缓凋亡途径[3-4]。Jee B等证实，在小分子热休克蛋白家族中，Hsp16.3可介导MTB在巨噬细胞内稳定生长，并延迟、减少巨噬细胞凋亡[5]。因此，明确Hsp16.3在MTB中的具体作用，以及其对巨噬细胞凋亡的影响和具体机制，对临床靶向治疗药物开发具有重要意义。

1 Hsp16.3蛋白分子结构及功能

Hsp16.3分布于MTB，由144个氨基酸组成，分子量约为16kDa，与ESAT6、CFP10等并称为Mtb相关抗原。正常情况下，细胞内少有或检测不到该蛋白表达。Hsp16.3可与巨噬细胞内蛋白结合，抑制巨噬细胞凋亡，从而增加Mtb的细菌内稳定性与生存率。Hsp16.3的C端由3部分组成，分别为C端尾（CTT），IXI模体与C端扩展区（CTE）。CTE主要介导蛋白低聚化解离与辅助增强Hsp16.3的分子伴侣功能。

Alok Kumar Panda等通过CTE基因敲除发现，CTE敲除后蛋白低聚化解离活性与Hsp16.3的分子伴侣功能均有所降低。见图1。

图1 Hsp16.3蛋白分子结构及功能

2 Hsp16.3介导MTB致巨噬细胞凋亡的作用及其发生机制

2.1 Hsp16.3介导MTB致巨噬细胞凋亡的作用

巨噬细胞凋亡是机体自我防御机制之一，其可有效促进MTB抗原暴露，向树突状细胞提成抗原，并促进T细胞活化，诱导免疫应答。巨噬细胞凋亡还能抑制MTB在体内的播散，激活未感染巨噬细胞，增强机体对MTB的杀伤力。在感染晚期，MTB增殖数量增多，MTB自身毒力因子、毒素等分泌增强，均可增加MTB抗凋亡能力，延缓巨噬细胞凋亡进程。

Hsp16.3可抑制巨噬细胞凋亡，增加Mtb的细菌内稳定性与存活率。庹清章等证实，在MTB感染早期、晚期，Hsp16.3的表达可有效抑制巨噬细胞凋亡。庹清章等[6]建立小鼠的感染模型，将MTB H37Rv Hsp16.3基因缺失强毒株注入小鼠体内，并与对照组比较，发现在感染早期、晚期，巨噬细胞凋亡率Hsp16.3基因未缺失组较Hsp16.3基因缺失组显著增高，且Bcl-2与Caspase-3也有显著增高。说明在MTB感染早期、晚期，Hsp16.3的表达可有效抑制巨噬细胞凋亡。刘云霞等[7]通过流式细胞技术发现，MTB感染巨噬细胞后，巨噬细胞内Hsp16.3蛋白表达增多。姚楠等[8]进一步研究发现，MTB致巨噬细胞凋亡的程度与Hsp16.3蛋白表达水平与MTB菌株毒力有关。MTB菌株毒力较弱时，巨噬细胞易发生早期凋亡。Hsp16.3蛋白表达水平较高且MTB菌株毒力较强时，巨噬细胞凋亡显著减少。在MTB隐性感染中，Hsp16.3也介导了MTB在细菌内稳定繁殖与免疫力低下时MTB激活。此外，Shi CH等[9]发现Hsp16.3蛋白可显著增高MTB菌落形成单位的数量，进一步证实Hsp16.3蛋白对MTB生长繁殖的重要性。

2.2 Hsp16.3介导MTB致巨噬细胞凋亡的机制

Hsp16.3介导MTB致巨噬细胞凋亡的机制目前尚不十分清楚，该进展归纳总结了4种可能的调控机制，见图2。

图2 Hsp16.3介导MTB致巨噬细胞凋亡的机制

2.2.1 Hsp16.3抑制微管结合蛋白LC3的表达 Shi CH等[9]证实，Hsp16.3抑制微管结合蛋白LC3的表达，进一步影响细胞凋亡的过程。LC3在细胞自噬或凋亡过程中具有识别与连接作用，当自噬或凋亡过程发生时LC3蛋白转变成LC3-II，并介导溶酶体与细胞识别，促进凋亡过程。Hsp16.3抑制LC3表达后，细胞质量控制（Quality Control）出现异常，巨噬细胞凋亡过程显著下降[10]。

2.2.2 Hsp16.3促进miR-181a与miR-146a降解Qing-Lin Meng等[11]利用U937细胞系作为体外巨噬细胞模型，通过对MTB感染巨噬细胞中mRNA种类与含量进行分析，发现Hsp16.3可抑制miR-181a与miR-146a，并促进已产生的miR-181a与miR-146a降解。从而直接参与MTB的免疫逃避过程。

2.2.3 Hsp16.3抑制TLR2表达及其正常作用 Haibo Su等[12]发现Rv2029c可通过TLR2介导的下游通路增加MHC-II的表达，进一步刺激CD4+T细胞活化与凋亡的形成。在MTB感染的巨噬细胞中，此通路可被Hsp16.3抑制，减少T细胞活化与凋亡的早期形成。

2.2.4 Hsp16.3促进LAG3过表达 此外，淋巴细胞活化基因3（LAG3）过表达时，CD4+T细胞介导的Th1细胞免疫应答显著减少，并加剧MTB在细胞内繁殖。Hsp16.3参与介导了LAG3的过表达，且与LAG3对细胞内MTB繁殖有协同作用[11]。

3 Hsp16.3临床应用前景

3.1 Hsp16.3相关分子早期检测

TLR2/TLR12介导的下游通路可增加MHC-II的表达，进一步刺激CD4+T细胞活化与凋亡的形成，在MTB感染的巨噬细胞中，Hsp16.3表达增多，并可抑制TLR2，使TLR2表达处在较低水平。 Qing-Lin Meng等利用U937细胞系作为体外巨噬细胞模型，通过对MTB感染巨噬细胞中mRNA种类与含量进行分析，发现miR-93-3p在巨噬细胞感染后显著下降，且在隐性感染模型中也可检测到含量变化。以上结果提示，TLR2/TLR12，Caspase-3，Bcl-2，TNFα，miR-93-3p可作为早期MTB感染的检测指标[13]。

3.2 靶向药物开发

如前所述，Hsp16.3表达增多时，可抑制TLR2，使TLR2表达处在较低水平。增加TLR2表达可作为MTB治疗靶点之一。刘红艳等[14]发现miR-19b沉默可上调TLR2表达，进一步促进MTB诱导的大鼠肺泡巨噬细胞凋亡。此外，Yongyan Wu等[15]证实Sp110可与Hsp16.3结合，阻断Hsp16.3与细胞内分子的结合，释放凋亡相关分子，使凋亡过程回到正常水平。另一方面，Sp110可与核糖体蛋白Rps3a结合，上调前凋亡聚合酶(PARP)表达水平，进一步促感染细胞凋亡。 以上结果提示，TLR2，miR-19b，Sp110 可作为MTB治疗靶点。

3.3 Hsp16.3疫苗研发

Geluk等发现，单独注射卡介苗并不能增强T细胞针对Hsp16.3的免疫应答作用，使疫苗在针对部分静止期胞内寄生MTB或隐形感染患者时大大减少[16]。C.Shi等发现，将Hsp16.3或其合成肽注入小鼠时，细胞免疫与体液免疫均较注射卡界面有所增强，且MTB增值有所减缓。实验结果提示，将Hsp16.3或其合成肽设计成疫苗，可能会刺激机体产生更有效的免疫应答[17]。

4 展望

该研究进展通过对Hsp16.3介导MTB致巨噬细胞凋亡作用及其发生机制的相关文献进行梳理，总结出 LC3，miR-181a、miR-146a，TLR2 与 LAG3 等 4 条可能的通路，并针对Hsp16.3提出早期分子检测、靶向药物开发、Hsp16.3疫苗研发等临床应用意见，以期为临床治疗提供帮助指导。但上述凋亡相关通路还需进一步阐明详细机制，Hsp16.3相关分子检测技术、临床用药、新型疫苗还有待进一步临床试验。

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