厚朴酚对脓毒症大鼠模型急性肺损伤的保护作用及机制

段金旗 林 艳 赵芹芳 徐昌富 马丽琼

(张家口学院医学院，河北 张家口 075000)

脓毒症是一种由致病微生物感染所引起的全身炎症反应综合征，病情进展迅速，死亡率高，如果没有得到及时有效的治疗，会发展成为多器官功能障碍综合征(MODS)等并发症，其中肺脏是易受累的器官之一〔1,2〕。急性肺损伤是脓毒症患者死亡的主要原因之一，减少脓毒症进展过程中的急性肺损伤，对提高患者生存率具有重要意义〔3〕。厚朴酚具有抗氧化，抗菌，抗内毒素，抗炎，抗肿瘤等药理作用，临床上主要用于炎症，细菌感染等疾病的治疗〔4,5〕。近些年来研究证实厚朴酚对脂多糖引起的大鼠急性肺损伤及脓毒症所致的胃肠动力障碍具有显著的治疗或者改善作用〔6,7〕，提示厚朴酚可能对脓毒症所导致的急性肺损伤可能具有改善作用，但此推测尚未见报道。本研究旨在探讨厚朴酚对脓毒症大鼠急性肺损伤的作用及相关机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 40只SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证书：SCXK(沪)2012-0002，大鼠自由饮食和摄水。

1.2主要试剂及仪器 厚朴酚购于中国食品药品检定研究院；兔抗人NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗体均购自美国Abcam公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-1β(IL-1β)，IL-6，细胞间黏附分子(ICAM-1)及巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-2酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，黄嘌呤氧化酶(XOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测试剂盒均购自北京索莱宝生物技术有限公司。ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；ELX800酶标分析仪购自美国Bio-Tek公司。

1.3建模及分组〔8,9〕40只大鼠随机分成4组，假手术组，模型组，厚朴酚低、高剂量组(4、8 mg/kg)，每组10只。模型组及厚朴酚组均参考相关文献方法行盲肠结扎复制脓毒症大鼠模型，造模大鼠均存活。假手术组打开腹腔找到盲肠后缝合腹壁切口，盲肠不作结扎穿刺。厚朴酚组大鼠分别腹腔注射给予4、8 mg/kg厚朴酚，假手术组及模型组给予等量生理盐水，连续3 d，1次/d。

1.4支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织标本的获得 在第3天，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，结扎大鼠右支气管，冲洗左肺支气管肺泡，获得肺泡灌洗液，采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒检测蛋白浓度，血细胞分析仪检测总白细胞数，Kwik-Diff染色法对中性粒细胞进行计数。另外取右肺下叶组织，清洗干净血迹，用于细胞因子及蛋白的检测。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 4%多聚甲醛固定右肺组织标本，石蜡包埋、切片(5 μm)，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ，70%、95%、95%、100%酒精，蒸馏水中脱蜡至水洗。苏木素染色，盐酸酒精分化，流水冲洗。梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性树脂封固，于镜下观察。肺损伤严重程度评分标准：肺泡，肺间质均正常计0分；肺泡，肺间质轻度水肿，少量出血，少量炎性因子浸润计1分；肺泡，肺间质较多炎性因子浸润，出血水肿，毛细血管淤血计2分；大量炎性因子浸润，肺泡腔显著出血水肿计3分。

1.6ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1及MIP-2含量 取部分右肺组织，眼科剪剪碎，匀浆机匀浆，15 000 r/min离心10 min，收集上清液，后取上清液严格按照TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1及MIP-2 ELISA试剂盒说明书检测各自含量。

1.7比色法检测MDA，SOD，XOD及GSH-Px活性 取部分右肺组织，眼科剪剪碎，匀浆机匀浆，15 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用比色法分别检测MDA，SOD，XOD及GSH-Px活性。

1.8Western印迹检测NF-κB信号通路相关蛋白表达 取右肺组织标本，匀浆机匀浆并裂解后，4℃，10 000 r/min离心10 min，收集上清液即是总蛋白，测定蛋白浓度。制作浓缩胶，分离胶，蛋白上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，后湿法转膜。一抗溶液(兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗体，稀释度均为1∶100)孵育，4℃过夜；次日于二抗溶液室温孵育1 h。于凝胶成像系统中曝光。

1.9统计学分析 应用SPSS17.0进行t检验。

2 结 果

2.1厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织病理形态及病理评分的影响 假手术组肺泡结构完整，肺泡间隙无明显的充血水肿，有极少量的炎性细胞浸润；模型组肺泡断裂，肺泡间隙明显充血水肿，并有大量炎性因子浸润；厚朴酚组肺泡结构较为完整，有少量炎性因子浸润。与假手术组比较，模型组病理评分显著提高(P<0.01)；与模型组比较，厚朴酚组病理评分显著降低(P<0.01)。见表1。

2.2厚朴酚对脓毒症大鼠BALF中蛋白含量，中性粒细胞及白细胞总数的影响 与假手术组比较，模型组中蛋白含量、中性粒细胞及白细胞总数均显著增加(P<0.01)；与模型组比较，厚朴酚低、高剂量组中蛋白含量，中性粒细胞及白细胞总数均显著减少(P<0.01)。见表1。

表1 厚朴酚对脓毒症大鼠BALF中蛋白含量， 中性粒细胞及白细胞总数的影响

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；下表同

2.3厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β及IL-6含量的影响 与假手术组比较，模型组TNF-α、IL-1β及IL-6含量均显著升高(P<0.01)。与模型组比较，厚朴酚低、高剂量组TNF-α、IL-1β及IL-6含量均显著降低(P<0.01)。见表2。

2.4厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织MDA含量、SOD、XOD及GSH-Px活性的影响 与假手术组比较，模型组中MDA含量及XOD活性提高(P<0.01)，SOD及GSH-Px活性降低(P<0.01)；与模型组比较，厚朴酚低、高剂量组中MDA含量及XOD活性降低(P<0.01)，SOD及GSH-Px活性提高(P<0.01)。见表3。

2.5厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织ICAM-1及MIP-2含量的影响 与假手术组比较，模型组中ICAM-1及MIP-2含量提高(P<0.01)；与模型组比较，厚朴酚低、高剂量组中ICAM-1及MIP-2含量降低(P<0.01)。见表4。

2.6厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组中p-IκBα及p-NF-κB p65表达量上调(P<0.01)；与模型组比较，厚朴酚低、高剂量组中p-IκBα及p-NF-κB p65表达量下调(P<0.01)。见图1，表4。

表2 厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β及IL-6含量的影响

表3 厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织MDA含量、SOD、XOD及GSH-Px活性的影响

表4 厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织ICAM-1、MIP-2含量及p-IκBα、NF-κB p65表达量的影响

A：假手术组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组图1 厚朴酚对脓毒症大鼠肺组织NF-κB 信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

研究表明，脓毒症所导致的急性肺损伤，最主要的发病机制是由于机体全身的瀑布式炎症反应，脓毒症发生时候，机体产生大量炎症介质及氧化脂质代谢物，促使中性粒细胞、白细胞等炎症细胞向肺组织聚集浸润，产生大量的炎性因子，趋化因子，氧自由基，最终损伤肺组织〔1,10〕。厚朴酚是一种从中药厚朴中提取出来的含有烯丙基的多酚类物质，具有显著的清除自由基、抗氧化作用，同时还具有显著的抗炎作用〔4,5〕。王雪冰〔7〕研究表明，厚朴酚能显著抑制脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤，与下调TNF-α、IL-1β表达有关。同时还有研究表明，厚朴酚能显著改善脓毒症引起的大鼠胃肠功能障碍〔6〕。从而推测厚朴酚对脓毒症引起的急性肺损伤可能具有显著的治疗作用，且机制可能涉及厚朴酚的抗氧化及抗炎作用。

相关文献显示〔11〕，使用4、8 mg/kg的厚朴酚干预脓毒症大鼠，并检测相关指标发现在脓毒症发生时，肺血管通透性增加，血管内大量的液体进入肺泡腔，导致BALF中炎症细胞数目增加的同时蛋白含量也显著升高〔1〕。本研究结果表明，厚朴酚能显著的降低BALF中蛋白浓度，减少中性粒细胞及白细胞数目。TNF-α是脓毒症早期最为重要的炎症因子，是炎症反应开始的触发因子，能够激活中性粒细胞，巨噬细胞等炎症细胞，并使炎症细胞释放IL-1β及IL-6等二级炎症因子，扩大炎症级联反应，加重肺组织炎症损伤〔12〕。另外ICAM-1是细胞黏附分子家族一员，被TNF-α激活后，能与中性粒细胞表面配体结合，促使中性粒细胞向炎症部位聚集，并激活T细胞〔10〕。MIP-2是趋化因子的一种，能够参与白细胞的活化与迁移，促使炎症反应进一步加大〔10〕。本研究结果表明，厚朴酚能显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1及MIP-2，提示厚朴酚能够通过减少炎症因子，趋化因子，黏附分子分泌进而抑制抑制脓毒症引起的急性肺损伤。

XOD是黄嘌呤核苷酸的分解酶，在脓毒症引起的急性肺损伤过程中，黄嘌呤脱氢酶变构为XOD，并产生大量的氧自由基，GSH-Px是机体内一种重要的氧自由基清除酶，能够清除脓毒症急性肺损伤过程产生的过氧化物及自由基，使肺组织避免氧化损伤；MDA是生物膜脂质过氧化的产物，能反映肺氧化损伤程度；SOD是机体内重要的抗氧化物酶，能够减轻氧自由基引起的肺损伤〔13〕。本研究结果提示厚朴酚可能通过提高机体抗氧化能力及清除自由基能力进而抑制脓毒症引起的大鼠急性肺损伤。

NF-κB是一种与炎症反应密切相关的核转录因子，炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6能够结合于特异性-κB位点，激活NF-κB信号通路〔14〕。NF-κB包含5个亚基，其中p65最为重要，在静息状态下，与IκB蛋白形成二聚体存在于细胞质中，在受到上游炎症信号刺激后，IκB被激活，并磷酸化，使p65释放出来进入细胞核，调控多种炎性相关因子表达，如趋化因子，黏附分子，细胞因子等〔14〕。厚朴酚能够显著抑制TNF-α诱导的人肺上皮细胞炎症反应，与抑制NF-κB信号通路继而降低ICAM-1表达有关〔15〕。本研究结果说明厚朴酚可能通过抑制NF-κB信号通路激活，发挥抗炎、抗氧化作用，最终抑制脓毒症引起的大鼠急性肺损伤。

综上所述，厚朴酚能显著改善脓毒症大鼠肺组织结构，减少炎症细胞浸润， 降低TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、MIP-2、MDA含量及XOD活性，提高SOD及GSH-Px活性，最终抑制脓毒症引起的大鼠急性肺损伤，其机制可能与阻断NF-κB信号通路有关。

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