下调Jagged1表达对骨髓瘤细胞增殖的抑制作用

张保龙 马利阁 尹万乐 李 达 宗淑君 王 芳 段小珍 尤笑迎

(郑州人民医院骨三科，河南 郑州 450000)

多发性骨髓瘤是一种恶性血液系统肿瘤〔1，2〕，是一种无法治愈的重大疾病〔3，4〕。Notch信号通路是细胞间相互作用的重要通路之一，在胚胎发育、细胞增殖和血管发生等过程中发挥重要调控作用。Jagged1是Notch受体的配体之一，有报道显示，Jagged1在肝癌、前列腺癌和结直肠癌等多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤细胞生长、肿瘤血管和免疫细胞浸润等过程关系密切〔5～8〕。Notch信号通路在骨髓瘤发病过程中发挥重要调控作用〔9〕，但其配体Jagged1在其中的作用未见报道。本研究旨在探讨干预Jagged1表达对骨髓瘤细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1RPMI8226细胞及培养 RPMI8226细胞购于中国科学院上海细胞库，采用含有10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培养基进行培养，孵箱条件为湿度饱和、温度37℃及CO2体积分数5%。待细胞贴壁后，以0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.1.2试剂与仪器 RPMI1640培养基、青链霉双抗、胎牛血清、OPTI-MEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙锭(PI)试剂盒、CCK-8试剂盒、电化学发光(ECL)试剂盒和反转录试剂盒均购于上海碧云天公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔/鼠免疫球蛋白(Ig)G、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、酶切半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3和β肌动蛋白(β-actin)抗体均购自美国Santa Cruz公司；CO2细胞培养箱、流式细胞仪、凝胶成像仪、酶标仪和电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司，低温高速离心机购于德国Sigma公司。引物由上海生工生物合成。

1.2方法

1.2.1分组及转染 取对数生长期RPMI8226细胞，以每孔25×103个细胞接种于6孔细胞板上，随机分为对照组(不做转染)、siRNA control组(转染negative control)和siRNA Jagged1组(转染Jagged1-siRNA)。当细胞融合度达70%左右时，吸去培养基，加无血清OPTI-MEM培养基继续培养。取两支EP管，一支加入浓度为20 μm siRNA 1μl和OPTI-MEM 49 μl，充分混匀后静止5 min；另一支：Lipofectamine2000 1 μl和OPTI-MEM 49 μl，充分混匀后静止5 min。将两支EP管溶液混合，反应20 min。取6孔细胞板，按照分组，将转染复合液分别加入siRNA Jagged1组和siRNA control组细胞中，置于CO2培养箱中继续培养5 h，为含血清的完全培养基。培养48 h后，收集各组细胞，鉴定其转染效果。

1.2.2Jagged1 mRNA检测 采用RT-PCR检测。以PBS洗涤对照组、siRNA control组和siRNA Jagged1组细胞后，参照RNA提取试剂盒步骤提取各组RPMI8226细胞的总RNA。以逆转录试剂盒反转录合成cDNA。将配制的50 μl反应体系(1 μl cDNA，各2 μl上下引物，1 μl Taq 酶，5 μl 10×PCR buffer，4 μl dNTP Mix，31 μl ddH2O)上样于PCR仪上；其中，每组设3个重复，按照95℃预变性 300 s(1×)，95℃变性 30 s(30×)，58℃退火30 s(30×)；72℃延伸30 s(30×)；72℃ 总延伸10 min(1×)参数进行PCR扩增。Jagged1上游引物：5′-AAGTGTGCCTCAAGGAGTATC-3′，下游引物：5′-ACTGTCAGGTTGAACGGTGTC-3′；β-actin上游引物：5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′，下游引物：5′-TGGGGGCGGCAGCGATGAG-3′。以β-actin为内参，2-△△CT法测定各组RPMI8226细胞中Jagged1 mRNA的相对表达量。

1.2.3Jagged1蛋白检测 采用Western印迹检测。取1.2.1中的目的细胞，加入RIPA裂解液提取各组RPMI8226细胞的总蛋白，以BCA蛋白检测试剂盒对总蛋白的浓度及纯度进行定量。取变性蛋白体积8 μl，每组设3个复孔，上样至浓度为120 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中电泳。结束电泳后，转膜。再将NC膜置于加有5%脱脂奶粉的1×TBST封闭液中，37℃下，振荡反应30 min。加入1 000倍稀释的特异性一抗(Jagged1抗体和β-actin抗体)，4℃下过夜，以TBST洗涤后，加入5 000倍稀释的HRP标记二抗，37℃下反应2 h。洗膜后，以ECL试剂盒显影，扫描图片，ImageJ软件分析各组RPMI8226细胞中Jagged1蛋白的相对表达量。

1.2.4RPMI8226细胞增殖检测 采用CCK-8法检测。取对数生长期RPMI8226细胞，以50×103个细胞150 μl/孔接种至96孔细胞板上，待细胞融合度70%以上时，按照1.2.1中的方法分组和转染。每组设置4个复孔，重复3次。在转染6 h后，分别孵箱中继续培养1 d、2 d或3 d后，弃上清液，每孔加入100 μl浓度为10%CCK-8溶液，孵育2 h后，以酶标仪检测细胞在490 nm处的吸光度(OD)值。

1.2.5RPMI8226细胞周期分布及凋亡检测 采用FCM检测。细胞周期实验：转染48 h后，制备对照组、siRNA control组和siRNA Jagged1组的细胞悬液(约20×103个细胞)。以PBS(预冷)洗涤细胞后，加入1 ml 70%冰乙醇固定过夜，离心后，以PBS洗涤，加入浓度为50 mg/L PI 1 ml染色，于4℃下避光反应30 min，上流式细胞仪检测。细胞凋亡实验：转染48 h后，制备对照组、siRNA control组和siRNA Jagged1组的细胞悬液，以PBS洗涤后离心。加入300 μl结合缓冲液制成含有约20×103个细胞的悬液，加入Annexin V-FITC 10 μl和PI 5 μl进行双染色，避光反应20 min后，补加结合缓冲液200 μl，上流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.6CyclinD1、Bcl-2和酶切caspase-3蛋白检测 采用Western印迹检测。转染48 h后，收集对照组、siRNA control组和siRNA Jagged1组细胞，经提取总蛋白、定量、电泳、转膜和封闭过程后，加入均为1 000倍稀释的一抗(CyclinD1抗体、Bcl-2抗体和酶切caspase-3抗体)，低温孵育过夜后，加入5 000倍稀释的二抗，2 h反应结束后，以ECL显影，Image J软件分析RPMI8226细胞中CyclinD1、Bcl-2和酶切caspase-3蛋白的相对表达量。具体步骤参照1.2.3。

1.3统计学方法 应用SPSS20.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1转染Jagged1-siRNA下调RPMI-8226细胞中Jagged1的表达 RT-PCR和Western印迹检测结果显示，与对照组(0.99±0.03，0.38±0.03)相比，转染48 h后siRNA control组Jagged1 mRNA和蛋白表达水平(1.02±0.05，0.41±0.02)差异无统计学意义(P>0.05)；而siRNA Jagged1组(0.17±0.02，0.12±0.01)均显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测各组RPMI8226细胞中 Jagged1蛋白表达

2.2下调Jagged1表达抑制RPMI8226细胞增殖 与对照组相比，转染1～3 d后，siRNA Jagged1组RPMI8226细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05)，而siRNA control组无明显改变(P>0.05)。见表1。

表1 下调Jagged1表达对RPMI8226细胞增殖的影响

与对照组比较：1)P<0.05；下表同

2.3下调Jagged1表达诱导RPMI-8226细胞周期阻滞和凋亡 转染48 h后，siRNA Jagged1 G0/G1期细胞比例和凋亡率较对照组均显著升高，S期细胞比例显著降低(P<0.05)；但siRNA control组细胞周期分布和凋亡率较对照组无明显变化(P>0.05)。见表2。

2.4下调Jagged1抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白表达并促进酶切caspase-3蛋白表达 与对照组比较，siRNA control组细胞中CyclinD1、Bcl-2和酶切caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但siRNA Jagged1组CyclinD1、Bcl-2蛋白表达明显减弱，酶切caspase-3蛋白表达明显增强(P<0.05)，见表3，图2。

表2 下调Jagged1表达对RPMI-8226细胞周期和凋亡的影响

图2 Western印迹检测Cyclin D1、Bcl-2和 酶切caspase-3蛋白表达

组别CyclinD1/β-actinBcl-2/β-actin酶切caspase-3/β-actin对照组0.47±0.060.55±0.050.15±0.02siRNA control组0.50±0.050.53±0.060.13±0.03siRNA Jagged1组0.23±0.021)0.27±0.031)0.49±0.061)

3 讨 论

Jagged1是一种单次跨膜糖蛋白，位于细胞膜上，是Notch受体配体中的重要一员，除了参与造血过程外，还可通过调控Notch信号通路在肿瘤血管形成、肿瘤增殖和转移等方面发挥重要作用〔10，11〕。高表达Jagged1与乳腺癌、肾癌和肺癌等淋巴结转移、临床分期、病理分级和总生存期差等关系密切〔12～14〕。Dai等〔15〕在结肠癌细胞中，以慢病毒Jagged1-siRNA下调Jagged1表达后发现，细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低，细胞被阻滞在G0/G1期；刘国燕等〔16〕通过特异性沉默卵巢癌中高表达的Jagged1基因发现，卵巢癌裸鼠移植瘤的生长受到抑制。此外，Jagged1对肿瘤化疗药物还有一定的增敏作用。叶欣等〔17〕在小细胞肺癌中研究发现，下调Jagged1的表达可增强细胞对化疗药物的敏感性，同时还能诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。目前，在骨髓瘤发生发展的机制研究中，Notch信号通路的研究较多，但对其配体Jagged1研究较少〔9，18〕。本研究结果提示，Jagged1基因在骨髓瘤的发生发展过程中发挥重要的调控作用。

肿瘤的形成发展与细胞增殖和凋亡的失衡关系密切，而细胞增殖又受细胞周期的影响。CyclinD1是细胞从G1期进入S期不可或缺的特异性周期蛋白，Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，而caspase-3是caspase家族中的执行凋亡蛋白，三者与骨髓瘤的发生发展、恶性程度和预后等密切相关〔19～21〕。本研究结果提示，在骨髓瘤中，Jagged1可能通过上调CyclinD1和Bcl-2及下调酶切caspase-3蛋白表达发挥促细胞增殖的作用，与袁磊等〔22〕研究结果吻合。

综上，下调Jagged1表达可抑制骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖，阻滞细胞于G0/G1期，并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与下调Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达及上调酶切caspase-3蛋白表达有关。

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