慢病毒介导siRNA干扰尿路上皮癌相关基因1表达对人肺腺癌细胞系A549恶性行为的影响

孙 莉 郭 颖 杨红兰

(胜利石油管理局胜利医院肿瘤科，山东 东营 257055)

肺腺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)的主要病理类型，占全部肺癌的50%以上〔1〕。绝大多数肺腺癌患者为周围型肺癌，早期症状轻，影像学特征不明显，且较易发生早期转移〔2,3〕。研究显示，尿路上皮癌相关基因(UCA)1参与包括膀胱癌、乳腺癌及结直肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展〔4〕，但其对肺腺癌细胞恶性行为的影响及相关机制尚不明确。本研究通过慢病毒体外介导靶向UCA1的小干扰RNA(siRNA)下调人肺腺癌细胞系A549中UCA1的表达，探究其对细胞增殖转移能力及上皮间充质转化(EMT)进程的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 实验细胞：包括人肺腺癌细胞系A549、H358、H1299、H460、人支气管上皮细胞系HBE及人肾上皮细胞系HEK293T(美国ATCC)。实验仪器：CO2细胞培养箱(美国Thermo，3111)、超净工作台(美国Thermo，Heraguard ECO 1.2)、低温高速离心机(德国Sigma，3-18K)、PCR基因扩增仪(美国Bio-Rad，S1000)、超微量分光光度计(美国Thermo，SMA2000)、实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems，7500)、酶标仪(北京普天，PT-3502)、光学显微镜(德国Leica，DM1000)、电泳仪、转膜仪及ChemiDoc XRS+化学发光成像系统(美国Bio-Rad)。实验材料：DMEM及RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone)、转染脂质体Lipofectamine 3000(美国Thermo)、慢病毒包装载体(pLP1,pLP2,pLP VSV-G，美国addgene)及慢病毒目的载体(pDECKO-UCA1,pDECKO-blank、美国addgene)、嘌呤霉素(美国Sigma)、RNA提取试剂、逆转录试剂盒及Sybr Green荧光染料(日本Takara)、MTS试剂盒(美国Promega)、基质胶(美国BD Biosciences)、IP裂解液及蛋白酶抑制剂(上海生工)、E-钙黏蛋白(cadherin)抗体(美国Sigma，SAB4503751)、波形蛋白(Vimentin)(美国Sigma，SAB4503083)、GAPDH(美国Sigma，G9545)、羊抗兔IgG(美国Sigma，RC05011A)、电化学发光法(ECL)发光试剂盒(美国Thermo)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及转染 人肺腺癌细胞系及人支气管上皮细胞系均使用RPMI1640培养基+10%胎牛血清，人肾上皮细胞系使用DMEM培养基+10%胎牛血清，培养于37℃，5%CO2生化培养箱中，超净工作台中进行严格无菌操作。慢病毒转染构建干扰组及对照组细胞：接种HEK293T细胞于六孔板中，取2支1.5 ml离心管加入1 ml DMEM培养基，均加入1.00 μg pLP1、0.50 μg pLP2、0.75 μg pLP VSV-G各病毒包装载体，分别加入2 μg pDECKO-UCA1载体及pDECKO-blank载体，室温静置10 min，均加入10 μl 转染脂质体，混匀后静置30 min，滴加入对数生长期的A549细胞中，保证培养基总体积为2 ml，4 h后更换DMEM培养基+10%胎牛血清培养48 h，收集细胞上清液(病毒悬液)并过滤，1∶1与RPMI1640培养基+10%胎牛血清混合培养A549细胞3 d，1 μg/ml嘌呤霉素筛选细胞7 d，完成干扰组及对照组细胞系的构建。

1.2.2RT-PCR检测细胞中UCA1的表达 收集1×105个干扰组及对照组细胞，以及人肺腺癌细胞系及人支气管上皮细胞系，1 ml RNA提取试剂重悬，进行细胞总RNA的抽提，超微量紫外分光光度计检测总RNA的含量，1 μg 总RNA进行逆转录，得到的cDNA模板用DEPC水稀释至500 μl，引物稀释至20 nmol/μl，相关序列如下：UCA1上游引物：5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游引物5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，按10 μl Sybr Green荧光染料体系上样，设置3个重复孔，ABI 7500系统分析每个上样孔的荧光强度，以GAPDH为内参基因，2-△△CT法计算UCA1的相对表达量。

1.2.3MTS实验检测两组细胞增殖能力 将干扰组及对照组细胞以1×104个/孔接种至96孔板中，设置3个重复孔，置于5%CO2、37℃培养箱中培养过夜。在0、12、24、48及72 h将MTS试剂与RPMI1640培养基+10%胎牛血清培养基1∶5混合均匀，替换原有培养基，生化培养箱中静置1 h，酶标仪检测样本490 nm处吸光度，两组细胞各时间点的吸光度与0 h的吸光度的比值作为衡量细胞相关增殖能力的依据。

1.2.4Transwell侵袭及迁移实验检测两组细胞侵袭迁移能力 稀释基质胶至50 mg/L，将Transwell小室置于24孔板中，取100 μl 基质胶加入Transwell小室膜中央，生化培养箱中放置6 h，无血清RPMI1640培养基水化基底膜30 min，无血清RPMI1640重悬干扰组及对照组细胞，细胞计数后调整细胞悬液浓度至5×105/ml，取200 μl(细胞数为1×105个)加至上小室，下小室加入500 μl RPMI1640培养基+10%胎牛血清，置于生化培养箱中培养24 h作为Transwell侵袭实验模型；另取未加入基质胶的Transwell小室置于24孔板中，同样加入200 μl上述细胞悬液，下小室加入500 μl RPMI1640培养基+10%胎牛血清，作为Transwell迁移实验模型。无水乙醇固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色30 min，棉签拭去上室面细胞，PBS洗上室面3次，100倍光镜下细胞计数，随机取中间和四周5个视野，计算平均值及标准差。

1.2.5Western印迹实验检测两组细胞E-cadherin及Vimentin的表达 收集1×106个干扰组及对照组细胞，500 μl IP裂解液+蛋白酶抑制剂重悬细胞，4℃裂解细胞1 h，4℃离心细胞10 min，取细胞上清液BCA法检测总蛋白浓度，配置30 μg上样体系，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白100 V转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，1∶500 E-cadherin抗体(135 kD)、Vimentin抗体(60 kD)、GAPDH抗体(37 kD)室温孵育相应蛋白条带2 h，1∶2 000二抗室温孵育1 h，ECL发光液曝光显影，扫描条带灰度值，将E-cadherin及Vimentin与相应GAPDH的比值作为衡量E-cadherin及Vimentin表达的依据。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件，两组计量资料比较采用两独立样本t检验；多组计量资料比较采用方差分析，SNK-q检验进行两两比较。

2 结 果

2.1肺腺癌细胞系与支气管上皮细胞系UCA1表达的比较 A549、H358、H1299、H460中UCA1的表达量分别为(0.279±0.024)、(0.146±0.017)、(0.185±0.011)、(0.216±0.025)，均显著高于HBE中UCA1的表达量(0.082±0.009)，差异具有统计学意义(F=16.330，P<0.01，两两比较：A549与HBE相比，q=13.827，P<0.01；H358与HBE相比，q=3.601，P<0.05；H1299与HBE相比，q=6.653，P<0.01；H460与HBE相比，q=8.143，P<0.01)。

2.2两组细胞UCA1表达的比较 干扰组UCA1的表达量(0.065±0.008)显著低于对照组(0.263±0.028，t=9.171，P<0.01)，干扰效率为73.2%。

2.3两组细胞增殖能力的比较 干扰组48及72 h细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组细胞各时间增殖能力的比较

2.4两组细胞E-cadherin及Vimentin表达的比较 干扰组细胞E-cadherin相对表达量为(0.630±0.113)，显著高于对照组细胞(0.371±0.086，t=3.159，P<0.01)；干扰组细胞Vimentin相对表达量为(0.124±0.036)，显著低于对照组细胞(0.295±0.061，t=4.217，P<0.01)，见图1。

图1 两组细胞E-cadherin及Vimentin表达的比较

2.5两组细胞侵袭及迁移能力比较 干扰组侵袭细胞数为(59.3±7.9)，显著少于对照组细胞数(92.8±10.2；t=3.681，P<0.01)；干扰组迁移细胞数为(64.6±8.5)，显著少于对照组细胞数(107.3±13.0；t=4.720，P<0.01)，见图2。

图2 两组细胞侵袭及迁移能力的比较(×100)

3 讨 论

UCA1属于长链非编码RNA中的一员，不编码相应蛋白，但却通过表观遗传及转录修饰等机制调控机体的生长发育〔5〕。近年有研究显示，UCA1不仅高表达于哺乳动物的胚胎组织中，且在多种恶性肿瘤中表达重新上调，并影响肿瘤细胞的恶性行为：①膀胱癌：Wang等〔6〕研究发现UCA1在膀胱癌组织及胚胎组织中表达显著上调，且可在体外促进细胞增殖及侵袭能力；Fan等〔7〕的研究显示UCA1可通过介导Wnt信号通路促进膀胱癌细胞对顺铂的化疗抵抗；Xue等〔8〕对UCA1促膀胱癌增殖转移的机制进行了探究，发现UCA1可通过激活has-miR-145-ZEB1/2-FSCN1通路发挥促癌作用。②乳腺癌：Tuo等〔9〕在乳腺癌组织中发现UCA1表达相比正常乳腺组织显著上调，并确定其可通过调控微小RNA-143(miR-143)的表达，促进细胞增殖并抑制凋亡的生物学作用；Liu等〔10〕的研究证实了UCA1对乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的促进作用。③结直肠癌：Han等〔11〕的研究发现在结直肠癌组织中UCA1表达上调，且可通过促进细胞周期进程及抑制细胞凋亡导致肿瘤细胞的生长；Bian等〔12〕发现UCA1不仅可促进结直肠癌细胞的增殖，且可通过抑制miR-204-5p的表达，介导结直肠癌细胞5-氟尿嘧啶抵抗的发生。④胃癌：Shang等〔13〕在胃癌组织中同样发现UCA1的高表达，通过siRNA下调胃癌细胞UCA1的表达后，细胞增殖及表阿霉素抵抗能力均显著下降。⑤肝细胞癌：Wang等〔14〕同样在肝细胞癌组织中检测到UCA1表达上调，且UCA1的表达与患者TNM分期及转移、复发密切相关，体外UCA1可促进肝癌细胞的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1的表达，进而介导细胞恶性行为的发生。⑥肺癌：Wang等〔15〕在非小细胞肺癌患者肿瘤组织及血清中发现UCA1的相对高表达，且其表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移密切相关；Nie等〔16〕体外干扰肺癌细胞UCA1表达后发现细胞增殖能力显著下调。上述研究均提示，UCA1在多种恶性肿瘤中发挥着重要的促癌作用，但目前关于UCA1对肺腺癌细胞增殖转移能力的影响及机制尚不明确。本研究通过慢病毒介导siRNA干扰肺腺癌细胞UCA1的表达后，观察细胞增殖转移能力的变化，明确了UCA1对肺腺癌细胞恶性行为的影响。本研究发现，UCA1在不同的肺腺癌细胞系中表达均显著上调，提示其可能参与促进正常支气管细胞恶性转化导致肺腺癌的发生过程。本文选择UCA1高表达的A549细胞系构建了慢病毒介导的siRNA体外干扰模型，发现干扰UCA1的表达后，A549细胞增殖及侵袭迁移能力均显著下调，从反面证实了UCA1对肺腺癌细胞恶性行为的促进作用。EMT是上皮来源恶性肿瘤的标志性特征，E-cadherin及Vimentin作为其重要的标志物，在EMT进程中发挥着关键作用：E-cadherin是维持上皮细胞间紧密连接的重要分子，细胞恶性转化时其表达往往下调，标志着细胞活动及侵袭能力增强〔17〕，而Vimentin在恶性肿瘤细胞中表达上调，标志着细胞活动性增强〔18〕。本研究显示下调A549细胞UCA1的表达后，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调，提示UCA1对肺腺癌细胞EMT进程的促进作用。

综上所述，本研究明确了UCA1可通过介导肺腺癌细胞EMT进程，促进细胞的增殖、侵袭及迁移。接下来的研究中，我们将通过实验进一步明确UCA1通过何种方式影响肺腺癌细胞的EMT进程，并通过动物模型明确UCA1对肺腺癌移植瘤及体内转移的影响，为揭示UCA1对肺腺癌发生发展的确切作用并指导相关临床诊治工作提供实验依据。

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