Claudin 3在肺鳞癌和腺癌的表达差异及预后探讨

车娟娟，王 婧，李卉惠，赵 磊，甄洪超，曹邦伟

肺癌是目前全球范围内发病率和死亡率均极高的恶性肿瘤之一，5年生存率徘徊在15%左右[1]。美国癌症协会（ACS）的最新数据显示：2018年美国预计有234,030例新发肺癌病例，预计将有154,050例患者死于肺癌，占所有癌症死亡总数的26%[2]。非小细胞肺癌（NSCLC）主要由肺鳞癌和腺癌构成，近年来腺癌比例逐渐增高。短期出现复发转移依旧是影响术后肺鳞癌和腺癌生存的主要因素。Claudins蛋白家族是细胞紧密连接的主要成分，其异常表达是肿瘤发展过程中的关键步骤，并且与多种肿瘤的预后相关[3-5]。本研究通过回顾性分析我院2010年1月—2014年12月行手术切除的肺鳞癌和腺癌患者各80例，免疫组化检测Claudin3的表达状况，探讨其在肺鳞癌与腺癌中的表达差异，并进一步分析其与临床病理因素和预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例收集：收集首都医科大学附属北京友谊医院2010年1月—2014年12月手术切除的肺鳞癌和腺癌石蜡包埋标本各80例，共计160例，请高年资的病理医师复习病理切片。

病例入选标准：（1）术前接受胸部CT扫描、脑CT或MR扫描、腹部B超或CT，排除脑、肝、肾上腺、对侧肺内无转移，全身ECT骨扫描检查（部分患者行PET-CT检查）排除骨转移的患者；（2）术前未接受任何放、化疗等抗癌治疗；（3）依据NCCN指南要求，行肺癌根治性切除术及随访资料完整患者为研究对象，排除术后1月内死亡病例。

治疗方式：所有患者均经手术治疗，其中I～Ⅲa期患者给予手术为主的综合治疗，Ⅱ-Ⅲa期患者术后予以辅助化疗，部分IIIa期患者行辅助放疗。其中化疗采用NSCLC的常规方案，包括长春瑞滨联合顺铂或卡铂（NP）、培美曲塞联合顺铂或卡铂（PP）、紫杉醇联合顺铂或卡铂（TP）、吉西他滨联合顺铂或卡铂（GP）等；放疗包括对病灶、纵隔及双侧锁骨上的淋巴结的放射治疗。

表1 肺鳞癌及腺癌患者的临床资料情况

1.2 免疫组化检测方法 采用免疫组化SP法对所有标本中的Claudin 3蛋白表达情况进行检测，具体方法：4 μm厚的组织切片常规脱蜡、梯度乙醇入水。应用3%的H2O2避光室温放置20 min封闭内源性过氧化物酶活性，使用0.1%枸橼酸缓冲液（pH 6.0）高温高压修复抗原后，滴加10%正常山羊血清反应20 min，加Claudin 3一抗（1:100稀释，Assay Biotech，Sunnyvale，CA，USA），4 ℃过夜后，加入生物素标记的二抗，在37 ℃孵育30 min，二甲基联苯胺（DAB）显色。封固后在光学显微镜下观察染色结果。以宫颈癌组织染色结果作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

免疫组化着色结果判断Claudin 3阳性表达定位于细胞膜。免疫组化反应根据染色强度和阳性细胞百分比分级为0～3级。0分：没有着色或者阳性细胞小于10%；1分：大于10%的肿瘤细胞浅着色或者10%～40%的细胞中等着色；2分：大于40%的肿瘤细胞中等着色或者10%～40%的肿瘤细胞强着色；3分：大于40%的细胞强着色。为了便于统计分析，将0～1分者定义为阴性组，将2～3分者定义为阳性组。

1.3 统计方法及随访 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，率的检验采用χ2检验，Kaplan-Meier法计算生存率，Log-rank检验进行单因素分析，多因素分析利用Cox回归模型进行，以P＜0.05为差异有统计学意义。生存时间定义为：自手术治疗之日至末次随访日或死亡的时间，以年为单位计算。失访或随访截止时仍存活者视为截尾数据，随访终止日期为2017年1月1日。

2 结果

2.1 Claudin 3在NSCLC中的表达情况及与临床病理因素的关系 免疫组化法检测Claudin 3表达如图1，Claudin 3阳性表达定位于细胞膜上。分析160例患者中，Claudin 3表达情况与临床病理因素关系，发现Claudin 3表达与性别、年龄、吸烟史、TNM分期及复发转移均无相关性，而仅仅与病理类型相关，结果如表2所示。2.2 患者生存的预后因素分析 应用Kaplan-Meier法对160例肺鳞癌和腺癌患者相关因素进行单因素分析显示：性别、年龄、吸烟史、病理类型、术后辅助化疗及Claudin 3表达等因素对患者生存率的影响无统计学意义（P＞0.05）。而T分期、N分期、TNM分期及是否复发转移等因素对患者生存率的影响有明显统计学意义（P＜0.05）（表3）。

图1 免疫组化检测Claudin 3在NSCLC组织表达情况

表2 160肺癌标本中Claudin 3阳性表达与临床因素的关系

对上述进行单因素分析的因素进一步纳入Cox回归模型，行多因素分析显示：TNM分期（P=0.000）和复发转移（P=0.000）是NSCLC独立的预后影响因素，其生存曲线分别如图2、图3所示。

2.3 Claudin 3表达状况在不同病理亚型分层分析结果 鉴于不同病理亚型中Claudin 3的表达差异，为了进一步明确Claudin 3在不同肺癌亚型的临床意义，我们进一步进行分层分析，结果如下表4所示。两个亚组的生存曲线如图4、5。

表3 NSCLC患者的预后因素的单因素分析结果

图2 不同TNM分期患者的生存曲线

图3 是否复发转移患者的生存曲线

表4 160例肺癌患者预后因素的分层分析结果

图4 鳞癌患者中不同Claudin3表达的生存曲线

图5 腺癌患者中不同Claudin3表达的生存曲线

3 讨论

肺癌是目前全球范围内发病率和死亡率均极高的恶性肿瘤之一。ACS数据显示：肺癌发病率的变化存在性别差异，自80年代以来，男性肺癌发病率一直在下降，2010—2014年，平均每年下降约2.9%；而女性肺癌发病率的下降滞后于男性，约从2005开始出现下降[6]。并且在临床实践中大约50%的病例是肺腺癌[7]。在我国，肺癌的发病率却逐年升高，并且在许多大城市肺癌的发病率已占常见恶性肿瘤的首位[8]。NSCLC约占肺癌的85%，肺鳞癌和肺腺癌构成NSCLC的主要病理类型，肺腺癌的发病率逐年升高，且肺腺癌更多见于非吸烟的患者[9]。手术切除为主的综合治疗可以明显提高患者生存率。NSCLC预后受多种因素影响，本研究通过多因素分析显示TNM分期（P=0.000）和复发转移（P=0.000）是NSCLC独立的预后影响因素。

Claudins跨膜蛋白家族是构成细胞紧密连接的主要骨架结构，它们可以直接调控TJ的渗透性。目前发现Claudins包括27种家族成员，远端肺上皮细胞主要表达Claudin 3（CLDN3）和Claudin 4[10]，CLDN3在肺的屏障功能中发挥了重要作用。同时CLDN3是产气荚膜梭状芽孢杆菌内毒素的天然受体，两者结合后能够导致细胞快速溶解，而产气荚膜梭状芽孢杆菌内毒素能够有效地抑制CLDN3表达的恶性肿瘤[11]，由此CLDN3将可能作为肿瘤治疗的潜在靶点。我们的研究发现CLDN3在IIIA期肺腺癌中的阳性表达率明显高于I期患者，并且CLDN3阳性表达患者的5年生存率明显低于阴性患者（34.9% vs 57.2%）。我们的研究结果与张连明等[12]的研究结果相一致，他们发现与癌旁正常组织相比，肺腺癌组织中CLDN3的表达量显著升高，并且CLDN3的过表达与肺腺癌细胞的恶性潜能及ERK1/2和PI3K-Akt信号通路相关。与肺腺癌相反，我们发现CLDN3在IIIA期肺鳞癌组织中的阳性表达率明显低于I期患者，CLDN3阳性表达患者的5年生存率明显优于阴性患者（57.4% vs 29.9%），这与我们之前的研究结果相一致[13]。并且我们之前的研究发现CLDN3可以通过抑制上皮间质转化进而抑制肺鳞癌侵袭和转移[13-14]。进一步对CLDN3进行分层并行生存分析显示CLDN3分别是肺鳞癌和肺腺癌的独立预后影响因素[14]。Judit等[15]也发现与正常肺组织相比，CLDN 3在肺腺癌中表达增加，而在肺鳞癌中表达下降。分析CLDN3在肺鳞癌和肺腺癌中表达差异的原因，我们推测与肺鳞癌和肺腺癌来源及肿瘤发生发展过程不同相关，肺鳞癌起源于段和亚段支气管黏膜上皮，经鳞状上皮化生、异型增生和原位癌等阶段再演进为肺鳞癌。而肺腺癌来自支气管的黏膜上皮和腺上皮，大多起源于较小的支气管黏膜分泌黏液的上皮细胞。此外，放射诱导的小鼠肺腺癌模型发现肺腺癌主要来源于II型肺泡上皮细胞，腺鳞癌和鳞癌来源于其它肺上皮细胞，而CLDN3主要是由II型肺泡上皮细胞表达[16]。因此CLDN3在肺腺癌中的高表达可能是相对的，而不是绝对的，Lin等[17]也认为在卵巢癌的形成过程中经历了间质上皮转化过程，而卵巢癌组织中CLDN3和Claudin4的高表达是相对的，而不是绝对的。目前所有文献报道中，尚未见到比较CLDN3不同表达程度对预后的影响，后续的研究中，我们会扩大病例数进一步研究探索。

T分期及N分期成为NSCLC预后的独立影响因素。依据国际肺癌研究协会（IASLC）最新数据库分析，IASLC对第七版肿瘤、淋巴结和转移（TNM）分期系统进行了修订。N分期方面维持不动，T 分期方面变动最大的是，肿瘤大小是一个重要的预后因素，具体为：距隆突小于2 cm的支气管及全部的肺不张/肺炎均归为T2，膈肌浸润归为T4，因为与T3相比，膈肌浸润的预后与T4更相似，纵隔胸腔浸润由于很少使用而不再用于描述T分期。我们依据15最新的TNM分期，T1、T2、T3及T4期5年生存率分别为57.6%、48.0%、22.8%和19.9%，发现随着T分期的增加，生存率逐渐下降，具有统计学差异（P=0.000）。此外，更新的推荐将IA期患者进行了细分；设立了ⅢC期，即T3和T4期且N3的患者，将Ⅳ期患者分为ⅣA期（胸腔内转移）和ⅣB期（单一/多发胸腔外转移）。我们的研究显示，I期、II期及IIIA期5年生存率分别为61.6%、46.3%和18.2%，发现随着TNM分期的增加，生存率逐渐下降，具有统计学差异（P=0.000）。这提示我们新TNM分期能够合理精确地指导术后恰当的综合治疗，结合我们的资料，新分期可以更加准确的反应预后。

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