雷公藤鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析

祝传书，刘 艳，陈蒙蒙，蒲 时，冯俊涛，2，张 兴，2

(1 西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心，陕西杨陵 712100；2 陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西杨陵 712100)

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，是一种重要的药用植物。在医学方面，具有抗癌[1]、调节免疫系统、治疗类风湿性关节炎[2]等作用。在农业方面，雷公藤对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目昆虫表现出较强的毒杀、拒食、麻醉、生长发育抑制和种群抑制等多种特异性杀虫作用[3]。雷公藤的主要活性成分为二萜、三萜等萜类物质和倍半萜类生物碱[4]，雷公藤红素就是从传统中药雷公藤根皮中提取分离得到的一种醌甲基三萜，因其具有重要的药理活性，而极具开发价值[5]，是雷公藤最具代表性的三萜物质，现被国内外广泛关注。作为一个天然药物，雷公藤红素不仅在抗肿瘤、抗炎与免疫抑制、抗神经退行性疾病等领域显示了良好的药理活性，还在治疗感染、涎酸贮积症及高血压病等疾病方面展示了其潜力[6-7]。但野生雷公藤生长周期长，次生代谢物含量低限制了雷公藤的应用。现在通过对萜类化合物生物合成途径中所涉及的关键酶进行克隆和表达调控，是提高植物中萜类化合物含量最有效的途径之一，同时也是代谢工程与合成生物学研究的基础。

鲨烯环氧酶(squalene epoxidase，SE，EC1.14.99.7)属于单加氧酶，所以又称为鲨烯单加氧酶，定位于内质网中，可催化鲨烯(角鲨烯)合成2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯经过糖基化、羟基化以及环化作用等修饰后可以得到不同的三萜物质[8]。2,3-氧化鲨烯是三萜类物质的前体物质，故鲨烯环氧酶的活性和含量决定了下游产物的产量。从三萜类化合物的合成通路发现，鲨烯环氧酶是其合成通路中的关键酶[9]，因此，鲨烯环氧酶被认为是三萜类化合物生物合成途径中一种重要的限速酶。鲨烯环氧酶作为三萜类化合物生物合成途径上的关键酶，在合成三萜过程中发挥着重要作用，因此雷公藤鲨烯环氧酶相关信息对于雷公藤三萜类物质的生物合成研究具有重要意义。目前鲨烯环氧酶已经在拟南芥[10]，蒺藜苜蓿[11]、人参[12]等多种植物中克隆得到并获得功能验证。

本研究从雷公藤中克隆得到了2个鲨烯环氧酶编码基因(TwSE1、TwSE2)，通过对其进行生物信息学分析，并结合荧光定量PCR方法检测其在不同组织部位的表达模式，以及在雷公藤发状根中受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理后基因表达量变化，为雷公藤三萜类物质生物合成研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

雷公藤植物采自于福建泰宁，经鉴定后移植于无公害农药研究服务中心；雷公藤发状根[13]保存于MS液体培养基中25 ℃，120 r·min-1于黑暗条件下振荡培养，每30 d继代1次。

1.2 方 法

1.2.1雷公藤发状根RNA提取选择培养2个周期(1个周期30 d)的雷公藤发状根，在培养发状根的MS液体培养基中加入MeJA诱导子，使诱导终浓度为100 μmol·L-1。于诱导后0、1、3、6、9、12、24、48 h后取样，液氮速冻后置于-80 ℃保存。利用Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(博日生物科技有限公司，杭州)提取雷公藤发状根总RNA。

1.2.2雷公藤不同组织RNA提取分别取雷公藤根、茎、嫩叶、老叶、花5个组织部位的材料，在液氮中速冻研磨，采用天根公司(北京)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取雷公藤各组织总RNA。

1.2.3cDNA合成根据PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书(TaKaRa)将MeJA诱导3 h的雷公藤发状根总RNA反转录成cDNA，用于基因克隆试验；利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)将雷公藤5个组织部位的总RNA和MeJA诱导处理的雷公藤发状根总RNA反转录为cDNA，用于荧光定量PCR试验。各试剂购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司。

1.2.4TwSE1与TwSE2基因克隆以反转录cDNA作为模板，按照下列体系对雷公藤TwSE1与TwSE2基因进行扩增。配制反应体系：1 μL cDNA、1 μL上游引物 (10 μmol·L-1)、1 μL下游引物 (10 μmol·L-1)、12.5 μL PrimeSTAR(TaKaRa)和9.5 μL ddH2O。反应程序: 95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 100 s，34个循环；72 ℃ 10 min；12 ℃保存。利用DNAMAN软件设计扩增TwSE1与TwSE2基因引物(表1，下划线碱基为相应酶切位点)。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对扩增所得目的片段进行切胶纯化回收。PCR产物回收后利用Premix Taq(TaKaRa)进行加“A”反应，然后连接pMD 19-T载体(TaKaRa)，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa)中，在氨苄抗性平板上进行筛选，再经菌落PCR检测后选择阳性克隆送北京奥科生物技术有限公司测序验证。

1.2.5TwSE1与TwSE2基因的生物信息学分析通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST搜索蛋白质和核苷酸数据库，并由DNAMAN软件翻译成氨基酸序列，使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找开放阅读框(ORF)。利用ExPASy Proteomics Server的在线软件对基因编码预测蛋白的理化性质进行预测。利用SOPMA对蛋白质的二级结构进行预测。采用InterproScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan)在线进行结构域比对预测保守结构域。应用在线SinalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services /Signal P/)软件分析蛋白是否含信号肽。使用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk /services/TMHMM/)预测蛋白跨膜区域。用DNAMAN软件对序列进行多重比对，通过MEGA6.0软件构建Neighbor-joining系统进化树，Bootstrap重复次数为1 000次。

1.2.6TwSE1与TwSE2基因差异表达采用CFX96 Real-Time PCR Detection System 扩增仪，检测TwSE1与TwSE2基因在雷公藤根、茎、嫩叶、老叶、花中的表达量，并检测雷公藤发状根受MeJA诱导后2个基因在不同时间点的表达量。反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)12.5 μL；正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL；cDNA 模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。于延伸阶段进行数据采集，65～95 ℃做融解曲线分析。每个反应重复3次，以Elongation factor 1 α(EF1α)为内参，用2-ΔΔCt法分析相对表达量。不同组织基因表达量以根中的表达量为对照，MeJA诱导后基因表达水平以处理0 h的表达量为对照。引物序列见表1。

2 结果与分析

2.1 雷公藤TwSE1与TwSE2基因的克隆

以雷公藤发状根cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到单一、特异的扩增带，片段大小约为1 600 bp(图1)。通过进一步分离分析，获得1条长为1 578 bp cDNA序列，将该基因命名为TwSE1(GenBank登录号MG717395)；1条长为1 584 bp cDNA序列，将该基因命名为TwSE2(GenBank登录号MG717396)。

2.2 雷公藤TwSE1与TwSE2基因序列生物信息学分析

2.2.1雷公藤TwSE1与TwSE2理化性质分析及二级结构预测利用 Protparam生物信息学工具对SE基因编码氨基酸序列进行理化性质分析，结果显示：TwSE1基因编码525个氨基酸，分子质量是57.34 kD，推测该蛋白的分子式为C2568H4100N706O728S26，等电点为8.74；不稳定系数为43.17，该蛋白为不稳定蛋白(不稳定系数<40时，预测蛋白质稳定，反之则不稳定)；总平均亲水性为0.050，具有疏水性。TwSE2基因编码527个氨基酸，分子质量是57.54 kD，推测该蛋白的分子式为C2596H4128N700O733S21，等电点为8.97；不稳定系数为35.65，该蛋白为稳定蛋白；总平均亲水性为0.085，具有疏水性。

图1 雷公藤TwSE1、TwSE2基因PCR扩增结果Fig.1 The PCR amplification of TwSE1 and TwSE2 gene

表1 克隆和RT-PCR引物Table 1 Primers designed for cloning and RT-PCR

利用SOPMA对蛋白质的二级结构进行预测结果表明，TwSE1蛋白的二级结构中α-螺旋占34.67%，延伸链占21.71%，β-转角占10.10%，无规则卷曲占33.52%；TwSE2蛋白的二级结构中α-螺旋占31.31%，延伸链占26.19%，β-转角占10.06%，无规则卷曲占32.45%。

利用InterProscan进行结构域分析(图2)，发现TwSE1和TwSE2基因编码蛋白都存在鲨烯环氧酶保守结构域，且都在212～484位氨基酸。TwSE1、TwSE2基因编码蛋白均含有2个FAD-结合位点，TwSE1在60～232位、326～436位氨基酸，TwSE2在61～232位、326～436位氨基酸。TwSE1与TwSE2基因编码蛋白的保守位点结构域基本一致，都有FAD结合位点和鲨烯环氧酶保守位点，显示出SE蛋白的共有特性。

2.2.2信号肽及跨膜区预测利用生物学软件Signal P4.1Server软件分析TwSE1和TwSE2编码的蛋白质序列，氨基酸残基的加权平均值分别为0.257、0.375,均小于0.5，由此推测TwSE1和TwSE2基因所编码的蛋白不存在信号肽为非分泌性蛋白。

使用TMHMM Server v.2.0对TwSE1及TwSE2编码蛋白进行跨膜结构域分析发现：TwSE1具有4个跨膜结构区，分别在6～25位、429～451位、455～477位、484～501位氨基酸；但TwSE2仅有1个跨膜结构区，在7～29位氨基酸(图3)。

2.2.3氨基酸序列比对及进化分析DNAMAN中多重序列比对分析，发现TwSE1、TwSE2基因编码氨基酸序列相似度高达76.18%，但是2个预测蛋白N-端氨基酸显示出很高的特异性，前60个氨基酸的相似性只有19.35%(图4)。利用Blast搜索NCBI上的核苷酸数据库和氨基酸数据库中近缘物种的SE序列信息，发现TwSE与其他植物SE氨基酸序列具有较高的相似性。雷公藤TwSE1基因氨基酸序列与人参、三七、蒺藜苜蓿等氨基酸序列相似度分别为80%、76%和75%，TwSE2分别为76%、79%和79%。

利用MEGA6.0软件采用邻结法(neighbor-joining，NJ)构建TwSE的系统进化树(图5)。可以看出，TwSE1、TwSE2与南非醉茄、玉米、蒺藜苜蓿聚为同一分支，并且TwSE1与南非醉茄聚为一支，亲缘关系最高，TwSE2与玉米聚为一支，亲缘关系最高。

图2 TwSE1(A)和TwSE2(B)蛋白保守结构域预测Fig.2 The conserved domains of TwSE1 and TwSE2 protein

图3 TwSE1和TwSE2蛋白跨膜结构预测Fig.3 Prediction of the transmembrane regions of TwSE1 and TwSE2 proteins

图4 雷公藤TwSE1、TwSE2氨基酸序列比对Fig.4 Amino acid alignment between TwSE1 and TwSE2 in T. wilfordii

图5 雷公藤TwSE蛋白系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of T.wilfordii TwSE proteins

2.3 TwSE1与TwSE2基因表达模式分析

2.3.1组织特异性表达分析利用实时荧光定量PCR方法检测TwSE1与TwSE2基因组织表达特异性，结果(图6)表明，2个基因在雷公藤根、茎、嫩叶、老叶、花中均有表达，但表达模式不同。TwSE1基因在花中表达量最高，在嫩叶和老叶中表达量相当但低于花，在茎中表达量低于嫩叶和老叶，在根中表达量最低。TwSE2基因在嫩叶和花中表达量相当表达量最高，在茎中的表达量高于根，在老叶中的表达量最低。

2.3.2MeJA诱导表达分析对雷公藤发状根进行MeJA诱导处理，实时荧光定量PCR分析SE基因诱导后不同时间的表达水平，结果(图7)显示，诱导后48 h内TwSE1相对表达量有不同程度的提高，诱导后3 h时达到一个高表达水平，是0 h的8.91

图6 TwSE1和TwSE2在雷公藤不同组织相对表达量Fig.6 Expression analysis of TwSE1 and TwSE2 on different tissues in T. wilfordii

图7 MeJA诱导后雷公藤发状根TwSE1和TwSE2基因的表达Fig.7 Expression analysis of TwSE1 and TwSE2 after MeJA treatment in T. wilfordii hairy roots

倍，之后表达量下降，随着时间的延长在诱导12 h后表达量又显著上升，24 h时表达量显著高于3 h，表达量水平是0 h的9.97倍。TwSE2与TwSE1呈现相同的变化趋势，诱导后3 h时达到一个高表达量水平，是0 h的1.95倍，之后表达量下降，但随着时间延长在诱导12 h后表达量又显著上升，诱导后24 h时表达量显著高于诱导后3 h，表达量是0 h的3.20倍。

3 讨 论

雷公藤作为重要的药用植物，因生长周期长、植物中次生代谢物含量低、资源不足等原因，急需构建体外生物合成的办法获得次生代谢产物。其中通过对萜类化合物生物合成途径中所涉及的关键酶进行克隆及表达调控，是利用代谢工程和合成生物学方法的基础，同时也是提高植物中萜类化合物含量最有效途径之一。目前对雷公藤三萜类生物合成途径研究较少，限制了雷公藤三萜类成分的合成生物学研究。本研究首次从雷公藤发状根中克隆得到2个鲨烯环氧酶基因，2个SE基因(TwSE1与TwSE2)具有较高的相似性。已知的鲨烯环氧酶均含有FAD结合区域，该区域涉及到与FAD结合的很多酶，这些酶以FAD为辅助因子参与多种催化反应[14]，是三萜类化合物生物合成中的关键位点[15]。雷公藤的2个SE中也都包含FAD结合的基序序列和典型的鲨烯环氧酶保守结构域，显示出SE家族的共有特性。雷公藤TwSE1蛋白具有4个跨膜螺旋，与三七中的2个SE一样[16]，但TwSE2蛋白仅有1个跨膜螺旋。SE被认为是定位于内质网膜上的酶[17]，因跨膜螺旋差异推测TwSE1和TwSE2两者在膜内外结构上可能存在差异。序列分析发现TwSE与其他物种的SE基因具有较高相似性，相似度达70%～85%，其中TwSE1与南非醉茄的亲缘关系最高，TwSE2与玉米亲缘关系最高。

不同物种中含有的SE基因拷贝数不同，植物中多含2个或2个以上类型的SE基因[18]，且不同植物SE基因表达的组织特性也存在差异[12,16]。本研究对克隆得到的2个SE基因进行不同组织部位表达分析，发现它们具有不同的组织表达模式。TwSE1与TwSE2基因在雷公藤5个组织部位均有表达，TwSE1基因在花中表达量最高，根中表达量最低；TwSE2基因在花和嫩叶中表达量最高，老叶中表达量最低。TwSE1在嫩叶和老叶中表达量相当，但TwSE2在嫩叶中的表达量是老叶中的表达量的3.48倍，显著高于老叶中的表达量，并且在各组织部位TwSE2的表达量都低于TwSE1。由此推测，在三萜物质代谢途径中TwSE1起主要催化作用，TwSE2起次要催化作用，2个SE基因在雷公藤三萜物质生物合成中的具体功能有待进一步分析。

茉莉酸甲酯(MeJA)广泛地存在于植物体中，外源应用能够激发防御植物基因的表达，具有提高植物次生代谢水平、增加三萜类次生代谢物累积的作用[19]。在人参根中发现SE与人参皂苷合成量高度相关，茉莉酸甲酯可诱导SE基因高表达同时增加三萜合成量[19]。由此推测MeJA能够能够激发雷公藤发状根SE基因的表达，提高三萜类物质合成量。本研究用MeJA诱导雷公藤发状根，通过实时荧光定量PCR检测，结果显示TwSE1基因与TwSE2基因在MeJA诱导后表达量变化都呈现先提高后下降然后再上升的趋势；且TwSE1在MeJA诱导后表达水平显著提高，TwSE2基因在MeJA诱导后表达水平较TwSE1提高幅度较小。受MeJA诱导后表达水平的提高表明雷公藤中2个SE基因都与三萜类物质合成相关，2个基因诱导后表达变化趋势一致表明2个基因可能有着相同的催化功能，但两基因表达水平的不一致又表明2个基因在三萜物质合成过程中催化作用可能不同，可能参与了不同的次生代谢途径。

本研究首次对雷公藤TwSE1与TwSE2基因进行了克隆与序列及表达模式的初步探索，研究结果为研究雷公藤三萜类物质生物合成途径提供了基础，同时为进一步利用代谢工程和合成生物学方法合成雷公藤三萜类化合物提供依据。

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