西南地区古杨树遗传多样性的SSR分析

纵 丹，周安佩，张 垚，李 旦，段丽华，何承忠,5*

(1 西南林业大学 云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，昆明 650224; 2 西南林业大学 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，昆明 650224; 3 西南林业大学 云南生物多样性研究院，昆明 650224; 4 昆明市林业科学研究所，昆明 650223; 5 西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，昆明 650224)

古树在多个自然环境因子以及人为因子长期综合作用下生存下来，已经适应当地的气候及土壤等环境条件，是最地道的乡土树种，具有较强的耐逆境能力，蕴藏有长寿及抗逆性等有价值的基因，因此，一棵古树就是一个基因库，是植物遗传改良的宝贵种质材料[1]，也具有重要的科研价值和社会价值[2-3]。

中国西南地区具有特殊的地形地貌及独特的地史条件，既有高原平面，又有高山峡谷，干热河谷气候、山地气候与高原气候并存，特别是横断山区山川胼列，南北走向，在第四世纪冰期来临时，为植物的退避提供了优异的条件[4-5]，从而使该区域蕴藏有丰富的杨树(PopulusL.)资源，是中国杨树自然分布及演化中心之一[4,6-8]。在资源调查中发现，西南地区分布着丰富的杨树古树资源，且树龄之古老，在现存的杨树资源中极为罕见，如四川省理塘县向阳寺周边及院内的西南杨(P.schneideri)，据记载是达赖三世率领僧侣于1546年种植[4]，距今已有近500年的树龄。西藏昌都县现存的一片昌都杨(P.qamdoensis)古树，胸径均在2 m以上，据当地居民估算，树龄在400年左右。这些珍稀而罕见的杨树古树既是研究杨属系统发育的理想材料，也是进行杨树遗传改良、种质创新的难得珍稀资源，可供选择育种的基因资源开发利用潜力很大[9]。通过对杨树古树遗传多样性的研究，能够充分了解其遗传变异水平、遗传结构及其遗传变异规律，从而为资源收集与保护、选择育种、杂交亲本选配等提供科学依据[10-12]。然而，目前关于该区域杨树古树的研究仅限于资源调查报道[4,9,13]，其遗传多样性研究等尚为空白。为此，本研究采集西南地区分布的川杨(P.szechuanica)、康定杨(P.kangdingensis)、乡城杨(P.xiangchengensis)、西南杨、藏川杨(P.szechuanicavar.tibetica)、德钦杨(P.haoana)和昌都杨7个种15个群体共226个杨树古树个体，采用SSR分子标记技术，从DNA水平对杨树古树的遗传多样性及其遗传关系进行分析，以期为该区域杨树古树资源的合理保护、收集与保存、科学开发与利用等提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以行政区划的县域作为群体划分依据，在同一县域内采集的同种杨树古树个体归为一个群体。分别在云南、四川和西藏3省11个县域内选取川杨、康定杨、乡城杨、西南杨、藏川杨、德钦杨和昌都杨共7种15个群体226株胸径在1 m以上的杨树古树样株(表1和图1)，采集新鲜嫩叶用变色硅胶干燥保存，带回实验室备用。

1.2 方 法

1.2.1基因组DNA提取采用改良SDS法依据标准酚/氯仿流程提取样本基因组总DNA[14]，利用1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪对所提取的基因组总DNA质量进行检测，-20 ℃保存，备用。

1.2.2SSR分析PCR反应体系(10 L)：10×PCR 缓冲液(含25 mmol/L Mg2+)1 L，dNTPs(2.5 mmol/L)0.7 L，上下游引物(10 mol/L)各1.5 L，Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)0.25 L，DNA模板2.5 L，双蒸水补足至10 L。

PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃～60 ℃(不同引物退火温度不同，详见表2)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR扩增产物检测：PCR扩增产物采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳产物采用银染法进行显影。

1.2.3数据统计与分析根据每个测试样本的扩

增产物在凝胶中电泳分离的带型差异，记为AA/AB/AC/BC等，构建数据矩阵。采用POPGENE version 1.32[15]软件计算观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s遗传相似系数、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Nei’s期望杂合度(Hn)、平均杂合度(Ha)以及固定指数Fis、Fit和遗传分化系数Fst及基因流Nm；基于Nei’s遗传相似系数，采用NTSYS软件[16]分别对杨树古树种间及群体间进行聚类分析；采用Structure 2.3.1进行Bayesian分析[17]，其模型选择混合模型和相关等位基因模型，预迭代次数设置为104，基于马尔科夫链的蒙特卡罗迭代运算105次，需检测的聚类数值K设定为1～20，每次检测均独立运行20次，采用Clumpp 1.1.2[18]进行数据的整理和分析。参照Evanno等[19]的方法确定最佳K值，聚类图通过Distruct 1.1[20]进行绘制。

图1 试验样本采集地分布图Fig.1 Collection map of the experimental samples

表1 试验材料来源基本信息Table 1 Basic information of experimental material source

表2 SSR引物序列及退火温度Table 2 The primer sequences and annealing temperature of SSR

2 结果与分析

2.1 杨树古树遗传多样性分析

筛选出7对SSR引物用于7种15个群体226株杨树古树样本分析，共扩增得到80个多态性位点，每对SSR引物扩增出多态性位点数在5～20个之间，平均为11.4个。POPGENE软件分析结果表明(表3)，杨树种间古树的遗传多样性参数存在较大差异，其中西南杨Ne最高，达3.920 8，德钦杨最低，仅为2.185 5；I最高值出现在藏川杨(1.401 4)，其余依次为西南杨(1.382 4)、昌都杨(1.374 7)、康定杨(1.371 6)、乡城杨(1.284 0)、川杨(0.997 8)和德钦杨(0.901 7)；Hn的变化范围为0.520 1～0.716 9，最高者是藏川杨(0.716 9)，最低者为德钦杨(0.520 1)。川杨Ho略高于He，而康定杨Ho与He较为接近，其余5个种Ho均低于He。以检测到的Ne作为标准，7种杨树古树遗传多样性水平由高到低依次为西南杨>昌都杨>康定杨>藏川杨>乡城杨>川杨>德钦杨。

杨树古树种内群体间遗传多样性分析结果表明，乡城杨3个群体之间的多态性位点百分率变化范围在71.43%～100%之间，Ne在2.207 9～3.303 2之间，I在0.710 1～1.194 7之间，Hn介于0.428 6～0.585 4之间，且均表现为GDX > GIX > GYX，其中GYX群体Ho远高于He，其余2个群体Ho略低于He；西南杨3个群体中，GDN群体多态性位点百分率为71.43%，而GLN群体和GIN群体均为100%，Ne和I在西南杨3个群体中的变化规律表现为GLN > GIN > GDN，且3个群体Ho高于He；藏川杨2个群体的多态性位点百分率均为100%，Ne和I较为接近，Ho低于He；Ne和I在德钦杨2个群体中的变化规律表现为GZD > GED，Ho低于He；昌都杨3个群体Ne和I均表现为HM > HG > HC，其中HM和HC群体Ho低于He，HG群体Ho高于He。

2.2 杨树古树的群体遗传分析(F-统计量)

以群体数不少于2的树种作为分析单元，分别对乡城杨、西南杨、藏川杨、德钦杨和昌都杨的F-统计量进行分析，结果(表4)表明，乡城杨Fis平均值为-0.024 6，表明乡城杨群体内杂合体较多；Fst变化范围在0.017 3～0.445 3之间，平均值为0.156 1，说明总的遗传变异中只有15.61%存在于群体间；群体间基因流平均值为1.351 3，表明乡城杨3个群体间存在一定的基因交流。西南杨7个位点中，除ORPM203和WPMS5位点Fis为正值，其余位点均为负值，平均值为-0.253 5，表明西南杨群体内杂合子过量；Fst平均值为0.253 5，而Nm为0.736 3，表明西南杨群体间遗传分化相对较大，而基因流较小。藏川杨、德钦杨和昌都杨Fis分别为0.205 4、0.240 1和0.029 2，表明藏川杨、德钦杨和昌都杨群体内均存在一定程度的近交，在总的遗传变异中分别有12.88%、18.20%和17.73%的遗传变异存在于群体间，群体间基因流分别为1.691 0、1.123 5和1.160 3，即藏川杨、德钦杨和昌都杨的遗传变异主要存在于群体内不同个体之间，且群体间存在一定的基因交流(表4)。此外，5种杨树古树群体的Fit值均大于Fis值，说明群体间的杂合水平高于群体内，因此，从各树种不同群体中进行个体选择可以获得较明显的增益。

表3 西南地区7种杨树古树的遗传多样性分析参数Table 3 Genetic diversity parameters of 7 large old poplars in southwest China

2.3 聚类分析

7种杨树的遗传相似系数介于0.089 0～0.691 0之间，平均为0.402 0。其中，川杨与康定杨之间的遗传相似系数最大，相似性水平最高，川杨与藏川杨之间的遗传相似性水平最低，二者之间的分化程度最大。基于各种间的Nei’s遗传相似系数，采用NTSYS软件对7种杨树进行UPGMA聚类分析，由聚类结果(图2)可看出，以0.450 0为阈值，7种杨树被明显地聚分为3大组，其中川杨和康定杨构成第1组，乡城杨和西南杨构成了第2组，第3组由藏川杨、德钦杨和昌都杨构成。

7种杨树15个古树群体的遗传相似系数变化范围在0.000 0～0.792 0之间，平均值为0.395 0。

图2 西南地区7种杨树古树的种间聚类结果Fig.2 Dendrogram among 7 large old poplars in southwest China

其中昌都杨昌都群体(HC)和贡觉群体(HG)之间的遗传相似系数最大，二者之间的相似水平最高，而西南杨稻城群体(GDN)和德钦杨德钦群体(GED)遗传相似水平最低。基于其遗传相似系数，采用NTSYS软件进行聚类分析，聚类结果(图3)显示，当遗传相似系数为0.330 0时，15个群体可被分为3个大组：第1大组包括川杨的泸定群体(GUC)、康定杨的康定群体(GXK)、乡城杨的3个群体(GDX、GIX和GYX)和西南杨的理塘群体(GLN)；第2大组由西南杨的2个群体(GDN和GIN)组成；其余7个群体构成第3大组。进一步对第1大组和第3大组进行聚分，当遗传相似系数为0.480 0时，可将第1大组分为2个亚组，其中：川杨与康定杨为第1亚组，乡城杨的3个群体及西南杨的理塘群体为第2亚组；第3大组分为2个亚组，其中：藏川杨的2个群体为第1个亚组，德钦杨的2个群体和藏川杨的3个群体为第2亚组。由此可见，除西南杨的理塘群体(GLN)与分城杨的3个群体聚为1组外，其余群体均可依据树种进行聚类，表明西南杨理塘群体(GLN)与乡城杨之间具有一定的遗传关系。

表4 西南地区5种杨树古树的群体遗传分析(F-统计量)结果Table 4 The result of population genetic analysis of 5 large old poplars in southwest China (F-statistic)

注：Fis.群体内近交系数；Fit.群体总近交系数；Fst.群体间遗传分化系数；Nm.群体间基因流
Notes:Fis. The inbreeding coefficient among populations;Fit. The total inbreeding coefficient among populations;Fst. The coefficient of genetic differentiation among populations;Nm. The gene flow among populations

图3 西南地区7种杨树古树不同群体的聚类结果Fig.3 Dendrogram of different populations of 7 large old poplars in southwest China

图4 K值判定Fig.4 The identification of K value

Bayesian分析的关键在于最佳K值的选择。本研究利用Structure软件[19]对226株杨树古树的群体结构进行分析，并采用2种方法确定最优K值，图4，A为基于Evanno等提出的方法[17,19]，当K值为3时，LK的上升趋势减缓，并逐渐趋于稳定，结合图4，B，K值在K=3时最大(6.48)，K=4时次之(5.86)，二者仅相差0.62，因此，分别对K=3和K=4进行聚类分析。当K=3时可将15个群体226株杨树古树分为3个组(图5，A)，第1组(蓝色)由川杨和康定杨组成，第2组(红色)由德钦杨2个群体(香格里拉和德钦群体)和昌都杨3个群体(芒康、昌都和贡觉群体)组成，其余杨树古树在第3组(绿色)中混杂分布，其中乡城杨与西南杨具有较近的亲缘关系，而藏川杨与德钦杨和昌都杨亲缘关系较近。当K=4时，聚类结果与K=3时类似，只是将藏川杨2个群体与乡城杨和西南杨区分开来(图5，B)；Bayesian分析结果与UPGMA聚类分析结果一致。

3 讨 论

基因多样性或基因杂合度是群体内每个位点上杂合体所占的比率或一个个体所有杂合位点的比率，也称为遗传多样性，是物种进化、选择、发生、创新和重组的物质基础[21-22]。遗传多样性评估主要采用的指标有多态带百分率、有效等位基因数、Shannon’s信息指数及观测杂合度和期望杂合度等[23-26]，其中，基因杂合度和有效等位基因数是度量遗传变异的重要参数，期望杂合度的大小可以反映遗传结构变异程度的高低[27-28]，杂合度高则遗传变异大，反之则变异小，而遗传变异的大小是衡量选择潜力的依据，变异大选择潜力大，反之则选择潜力小[29]。曾淇等[28]采用SSR分子标记对46份荔枝种质资源遗传多样性进行分析，22个SSR位点的平均期望杂合度为0.355 0，表明荔枝群体的遗传结构变异程度为中等。冯源恒等[30]采用SSR标记对拉雅松(Pinuscrassicorticea)遗传多样性进行研究，7对SSR引物组合共检测有效等位基因数为1.653 0，Shannon’s信息指数为0.540 0，观测杂合度为0.577 0，期望杂合度为0.374 0，表明拉雅松具有较高水平的遗传多样性。包文泉等[31]基于SSR标记对新源县、霍城县、伊宁县和巩留县4个群体共80份新疆野杏样本的遗传多样性及遗传结构进行分析，在群体水平上，27对SSR引物共检测有效等位基因数、Shannon’s信息指数、观测杂合度和期望杂合度分别为5.85、1.92和0.79和0.55，且新源县野杏群体遗传多样性最丰富，巩留县群体遗传多样性最低。本研究采用SSR标记对7种杨树古树遗传多样性进行分析，结果表明7种杨树古树的有效等位基因数变化范围在2.188 5～3.920 8之间，Shannon’s信息指数在0.901 7～1.401 4之间，观测杂合度和期望杂合度变化范围分别介于0.363 1～0.741 5和0.531 2～0.726 5之间，德钦杨各项遗传参数均表现最低，表明7种杨树古树均具有较高的遗传多样性，而德钦杨的遗传多样性较其余种低。GYX群体的多态性位点百分率、有效等位基因数、Shannon’s信息指数和Nei’s期望杂合度均低于GIXGDX群体，且GYX群体观测杂合度远高于期望杂合度，GYX群体个体数量较少，导致群体不同程度的近交，从而使其纯合机率增加，杂合度降低，其余2个群体观测杂合度略低于期望杂合度，群体内不同个体间的遗传多样性丰富。昌都杨3个群体(HM、HC、HG)和西南杨3个群体(GLN、GDN、GIN)的有效等位基因数、Shannon’s信息指数和Nei’s期望杂合度3项遗传参数的大小顺序依次为HM>HG>HC，GLN>GIN>GDN，GLN群体观测杂合度与期望杂合度较为接近，西南杨其余2个群体和昌都杨3个群体，观测杂合度与期望杂合度之间均有一定差值，表明不同群体在生长过程中受到外来选择、近交以及一些非随机因素的影响，而偏离了遗传平衡状态[32]。

图5 西南地区7种杨树古树及其群体的Bayesian分析结果Fig.5 The Bayesian analysis of 5 large old poplars and their populations in southwest China

Wright提出的3个固定指数Fis、Fit和Fst是反映群体近交程度和遗传分化程度的指标，Fis和Fit值介于-1～1之间，其值越大说明近交越严重；Fst值变化范围为0～1之间，值越大说明群体间遗传分化越明显[33]。薄文浩[34]应用SSR分子标记对藏川杨不同群体的近交程度进行分析，结果表明除林芝群体近交系数接近0.2，拉萨、日喀则和山南来源藏川杨近交系数均接近0，说明林芝群体存在藏川杨纯合子相对杂合子过量的现象，其余3个群体杂合子与纯合子比例接近，藏川杨可以完全随机交配。本研究中，乡城杨群体内近交系数Fis为-0.024 6，表明乡城杨群体内杂合子较多，群体间遗传分化系数为0.156 1，即在总的遗传变异中只有15.61%的变异存在于群体间，群体间基因流为1.351 3，表明乡城杨3个不同群体间存在一定的基因交流。乡城杨群体间较小的遗传变异和较高基因交流可能主要来源于人为引种栽培。西南杨群体内近交系数为-0.253 5，表明西南杨群体内杂合子过量，群体间遗传分化系数为0.253 5，基因流为0.736 3，即西南杨群体间基因交流受阻，从而使其走向遗传分化，而西南杨不同群体之间的地理隔离可能是导致群体基因交流受阻的主要原因。藏川杨、德钦杨和昌都杨群体间近交系数分别为0.205 4、0.240 1和0.029 1，群体间遗传变异分别占总变异的12.88%、18.20%和17.73%，表明藏川杨、德钦杨和昌都杨群体内均存在一定程度的近交，纯合子相对杂合子过量，且不同群体间存在一定程度的基因交流。由此可见，西南地区杨树古树的遗传变异丰富，无论从各树种的群体内进行选择，或是从群体间进行选择，均可获得较大的遗传增益。

在遗传水平上，遗传相似系数的变幅越大，种内遗传差异越大，遗传多样性越高，反之遗传相似系数越接近，物种亲缘关系越近[35]。乡城杨稻城、乡城和雅江3个群体之间的遗传相似系数介于0.600 0～0.766 0之间，变幅较小，在聚类图中，乡城杨3个群体也聚合在一起，表明虽然不同群体间由于较远的地理隔离发生了一定的分化，但在DNA水平上还可以保持一定的同源性和一致性。由昌都杨群体间的遗传相似系数可知，昌都群体与贡觉群体遗传相似系数较大(0.792 0)，芒康群体与昌都群体和贡觉群体的遗传相似系数分别为0.633 0和0.404 0，且在UPGMA聚类图中也表现为昌都群体与贡觉群体聚在一起，这是由于东达山等山脉形成了地理隔离，导致昌都杨芒康群体与其余2个群体之间的遗传相似系数较小，亲缘关系相对较远。西南杨群体的聚类结果显示，西南杨理塘群体与乡城杨3个群体聚为一类，而其余2个群体聚为一类，这一结果进一步支持了刘友全等[36]依据表型特征认为乡城杨是西南杨与长序杨(P.pseudoglauca)的自然杂交种的观点。何承忠等[37]对西南藏区山杨(P.davidiana)群体遗传结构分析发现，西南地区错综分布的山脉对山杨群体具有显著的隔离作用。本研究中西南杨不同群体间有海子山、兔儿山及无名山等高大山脉的阻隔，可能是导致西南杨群体间存在较大遗传差异的原因。

川杨与藏川杨的表型特征非常相似，区别仅为藏川杨叶初时两面有短柔毛，后仅沿叶脉有柔毛，芽和叶柄均有短柔毛，而川杨的叶、叶柄及芽均无毛[38]。本研究中，藏川杨与川杨间的遗传相似系数较低，在种水平或群体水平均未能相聚，与Wan等[39]采用AFLP标记与trnT-trnF片段序列、员涛等[40]采用SRAP标记、李佳蔓等[41]采用cpDNA和rDNAITS片段序列的研究结果一致。中国西南地区独特的地形地貌，复杂多样的气候条件，纵横交错的山脉阻隔以及强烈的冰川作用，造就了变化多端的杨树生境条件，使该区域分布杨树的表型可塑性较为丰富，且青杨派树种之间的自然杂交现象极为普遍，致使该区域杨树系统关系及分类地位的确定难度较大[4,36]。本研究基于群体的聚类分析也证实了西南地区杨树之间较为复杂的遗传关系。

通过对西南地区杨树古树的遗传多样性研究表明，杨树古树具有较高的遗传多样性，且遗传变异主要存在于群体内不同个体之间，因此任何个体的丧失均会导致杨树古树遗传多样性的降低或丧失。然而前期对西南地区杨树古树资源调查的过程中发现，许多杨树古树的树干出现腐朽、中空等损伤，且尚未采取任何的保护措施，最终将会导致杨树古树的死亡与消失，因此，亟需对西南地区不同种的杨树古树资源进行就地保护、扩繁保护及收集保存。此外，经历上百年甚至几百年生长历程保存下来的古树，蕴藏有长寿、抗病虫害、抗盐碱性、抗旱和抗寒以及其他具有巨大应用潜力的珍稀基因资源，而这些杨树古树中优良基因资源的开发与利用，还有待于进一步深入发掘，从而服务于中国杨树育种事业。

参考文献:

[1] 胡坚强, 夏有根, 梅 艳, 等. 古树名木研究概述[J]. 福建林业科技, 2004,31(3): 151-154.

HU J Q, XIA Y G, MEI Y,etal. Research of the ancient and famous trees in China[J].JournalofFujianForestryScienceandTechnology, 2004,31(3): 151-154.

[2] LINDENMAYER D B, LAURANCE W F, FRANKIN J F. Global decline in large old trees[J].Science, 2012,338(6112): 1 305-1 306.

[3] FAISON E K. Large old tree declines at broad scales: a more complicated story[J].ConservationLetters, 2014,7(1): 70-71.

[4] 余树全, 刘 军, 付达荣, 等. 川西高原青杨派基因资源特点[J]. 浙江林学院学报, 2003,20(1): 27-31.

YU S Q, LIU J, FU D R,etal. Characteristics ofTacamahacagenes in the Western Sichuan plateau[J].JournalofZhejiangForestryCollege, 2003,20(1): 27-31.

[5] 龚固堂. 杨属地理分布与起源初探[J]. 四川林业科技, 2004,25(2): 25-30.

GONG G T. The geographic distribution and origin ofPopulusL.[J].JournalofSichuanForestryScienceandTechnology, 2004,25(2): 25-30.

[6] 赵 能, 刘 军. 中国西南地区杨属的分类学研究(I)[J]. 武汉植物学研究, 1991,9(3): 229-238.

ZHAO N, LIU J. Taxonomic studies onPopulusL. in southwest China (I)[J]. JournalofWuhanBotanicalResearch, 1991,9(3): 229-238.

[7] 刘 军. 川西高原青杨派杨树的地理类型[J]. 四川林业科技, 1997,18(2): 36-39.

LIU J. Geographical types ofTacamahacain the western Sichuan plateau[J].JournalofSichuanScienceandTechnology, 1997,18(2): 36-39.

[8] WAN X Q, ZHANG F. An overview ofPopulusgenetic resources in southwest China[J].TheForestryChronicle, 2013,89(1): 79-87.

[9] 万雪琴, 张 帆, 钟 宇, 等. 中国西南地区乡土杨树基因资源的保护与利用[J]. 林业科学, 2009,45(4): 139-144.

WAN X Q, ZHANG F, ZHONG Y,etal. Conservation and application of the genetic resource of native poplars in southwest China[J].ScientiaSilvaeSinicae, 2009,45(4): 139-144.

[10] LEE K M, KIM Y Y, HYUN J. Genetic variation in populations ofPopulusdavidianaDode based on microsatellite marker analysis[J].GenesandGenomics, 2011,33(2): 163-171.

[11] ADAMI M, FRANCESCHI P D, BRANDI F,etal. Identifying a carotenoid cleavage dioxygenase (ccd4) gene controlling yellow/white fruit flesh color of peach[J].PlantMolecularBiologyReporter, 2013,31(5): 1 166-1 175.

[12] VENDRAMIN E, PEA G, DONDINI L,etal. A unique mutation in a MYB gene cosegregates with the nectarine phenotype in peach[J].PLoSOne, 2014,9(10): e90574.

[13] 贾 晨, 鄢武先, 何承忠, 等. 川西高原乡土杨树古树资源调查及保护对策[J]. 四川林业科技, 2014,35(1): 31-35.

JIA C, YAN W X, HE C Z,etal. Investigation and protection of large old native poplars in West Sichuan plateau[J].JournalofSichuanForestryScienceandTechnology, 2014,35(1): 31-35.

[14] MURRAY M, THOMPSON W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].NucleicAcidsResearch, 1980,8(19): 4 321-4 326.

[15] YEH F C, YANG R, BOYLE T J. PopGene32, Microsoft Windows-based Freeware for Population Genetic Analysis (version 1.32)[M]. Alberta, Canada: Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, 1999.

[16] ROHLF F J. NTSYS-pc Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.02 User Guide [M]. Applied Biostatistics lnc, Exeter Software, Setauket, New York, 1997.

[17] PRITCHARD J K, STIPHENS M, DONNELLY P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J].Genetics, 2000,155(2): 945-959.

[18] JAKOBSSON M, ROSENBERG N A. CLUMPP: a cluster matching and permutation program for dealing with label switching and multimodality in analysis of population structure[J].Bioinformatics, 2007,23(14): 1 801-1 806.

[19] EVANNO G, REGNAUT S, GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study[J].MolecularEcology, 2005,14(8): 2 611-2 620.

[20] ROSENBERG N A. DISTRUCT: a program for the graphical display of population structure[J].MolecularEcologyResources, 2004,4(1): 137-138.

[21] 张 静. 利用SSR分子标记研究山杨杂种无性系的遗传多样性[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2003.

[22] 徐爱遐, 马朝芝, 肖恩时, 等. 中国西部芥菜型油菜遗传多样性研究[J]. 作物学报, 2008,34(5): 754-763.

XU A X, MA C Z, XIAO E S,etal. Genetic diversity ofBrassicajunceafrom Western China[J].ActaAgronomicaSinica, 2008,34(5): 754-763.

[23] NEI M. Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].ProceedingsoftheNationalAcademyScienceofUSA, 1973,70(12): 3 321-3 323.

[24] NEI M. F-statistics and analysis of gene diversity in subdivided populations[J].AnnalsofHumanGenetics, 1977,41(2): 225-233.

[25] RIEGER R, MICHELIS A, GEEN M M. Glossary of genetics[M]. Berlin: Springer-Verlag, 1991: 209.

[26] 王伯荪, 彭少麟. 植被生态学-群落与生态系统[M]. 北京: 中国环境科学技术出版社, 1997: 201-220.

[27] 盖钧镒. 植物种质群体遗传结构改变的速度[J]. 植物遗传资源学报, 2005,6(1): 1-8.

GAI J Y. Indicators related to genetic structure changes of plant germplasm population[J].JournalofPlantGeneticResources, 2005,6(1): 1-8.

[28] 曾 淇, 李明芳, 郑学勤. 基于SSR标记的荔枝种质遗传多样性分析[J]. 植物遗传资源学报, 2010,11(3): 298-304．

ZENG Q, LI M F, ZHENG X Q. Analysis of genetic diversity withinLitchivarieties based on SSR markers[J].JournalofPlantGeneticResources, 2010,11(3): 298-304.

[29] 周炎花, 乔小燕, 马春雷, 等. 广西茶树地方品种遗传多样和遗传结构的EST-SSR分析[J]. 林业科学, 2011,47(3): 59-67.

ZHOU Y H, QIAO X Y, MA C L,etal. Genetic diversity and structure of tea landraces from Guangxi based on EST-SSR analysis[J].ScientiaSilvaeSinicae, 2011,47(3): 59-67.

[30] 冯源恒, 吴东山, 王德俊, 等. 拉雅松遗传多样性及同域分布种间亲缘关系分析[J]. 广西植物, 2014,34(3): 320-325.

FENG Y H, WU D S, WANG D J,etal. Genetic diversity ofPinuscrassicorticeaand its genetic relationship with two sympayric pine species[J].Guihaia, 2014,34(3): 320-325.

[31] 包文泉, 乌云塔娜, 王 淋, 等. 基于SSR标记的新疆野杏群体遗传多样性及遗传结构[J]. 西北植物学报, 2016,36(9): 1 757-1 763.

BAO W Q, WUYUN T N, WANG L,etal. Genetic diversity and population structure of wild Apricot in xinjiang revealed by SSR markers[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2016,36(9): 1 757-1 763.

[32] FERRIOL M, MERLE H, GARMENDIA A. Microsatellite evidence for low genetic diversity and reproductive isolation in tetraploidCentaureaseridis(Asteraceae) coexisting with diploidCentaureaasperaand triploid bybrids in contact zones[J].BotanicalJournaloftheLinnaeanSociety, 2015,176(1): 82-98.

[33] WRIGHT S. The genetical structure of populations[J].AnnalsofEugenics, 1951,15: 323-354.

[34] 薄文浩. 藏川杨遗传多样性及杂交子代遗传变异研究[D]. 北京: 北京林业大学, 2012

[35] 牛素贞, 刘玉倩, 杨锦标, 等. 贵州茶树地方品种的EST-SSR遗传多样性分析[J]. 浙江农业学报, 2012,24(5): 836-841.

NIU S Z, LIU Y Q, YANG J B,etal. Analysis of genetic diversity of tea landrace resources in Guizhou by EST-SSR markers[J].ActaAgricultureZhejiangensis, 2012 ,24(5): 836-841.

[36] 刘友全, 付达荣. 川西高原青杨组基因资源及开发利用[J]. 中南林学院学报, 2004,24(5): 129-131.

LIU Y Q, FU D R. Development and utilization of Sec.Tacamachacagene resources on the plateau of western Sichuan[J].JournalofCentralsouthForestryUniversity, 2004,24(5) : 129-131.

[37] 何承忠, 李佳蔓, 员 涛, 等. 地理隔离对西南藏区山杨居群遗传结构影响的SRAP分析[J]. 林业科学研究, 2015,28(2): 152-157.

HE C Z, LI J M, YUN T,etal. SRAP analysis on the effect of geographic isolation on population genetic structure ofPopulusdavidianain Tibetan-inhabited regions in southwest China[J].ForestResearch, 2015,28(2): 152-157.

[38] 赵 能. 川西及其邻近地区杨柳科植物分类的研究(三)[J]. 四川林业科技, 1994,15(2): 1-11.

ZHAO N. Taxonomic study on Salicaceae in Sichuan and its adjacent regions (Third)[J]. SichuanForestryScienceandTechnology, 1994,15(2): 1-11.

[39] WAN X Q, ZHANG F, ZHONG Y,etal. Study of genetic relationships and phylogeny of the nativePopulusin southwest China based on nucleotide sequence of chloroplasttrnT-trnF and nuclear DNA[J].PlantSystematicsandEvolution, 2012,299(1): 57-65.

[40] 员 涛, 颜璐茜, 李佳蔓, 等. 西南地区乡土杨树遗传变异的SRAP分析[J]. 植物遗传资源学报, 2015,16(4): 836-841.

YUN T, YAN L X, LI J M,etal. SRAP analysis of genetic variation among native poplars in southwest China[J].JournalofPlantGeneticResources, 2015,16(4): 836-841.

[41] 李佳蔓, 员 涛, 周安佩, 等. 基于cpDNA和rDNAITS片段分析西南地区青杨派杨树的系统发育与进化关系[J]. 西北植物学报, 2015,35(6): 1 113-1 122.

LI J M, YUN T, ZHOU A P,etal. Phylogeny of poplar in sectionTacamahacaspecies from southwest China based on sequence data of cpDNA fragments and rDNAITS[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2015,35(6): 1 113-1 122.