NADPH-d在大鼠三叉神经节的表达

刘永亮，丁桂聪

深圳市儿童医院口腔科，广东深圳 518000

三叉神经节（trigeminal ganglion,TG)是三叉神经传导通路的主要初级传入神经元，主要负责颌面部的机械感觉、温度感觉与痛觉传导，在颌面部感觉调控发挥重要作用[1-2]。

一氧化氮（nitric oxide,NO)虽是短半衰期的自由基分子，但在疼痛传导调控中发挥着重要作用，受到广泛关注[3-4]。NO是以左旋精氨酸（L-Arginine）为底物，由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase,NOS）合成。而NOS有3种亚型，包括神经元型NOS（constitutive neuronal NOS,nNOS）， 诱导型 NOS（inducible NOS,iNOS）与内皮型 NOS（endothelial NOS,eNOS）。nNOS与eNOS又称为固有型NOS，属于钙依赖型，主要存在于中枢神经系统。iNOS主要存在于巨噬细胞和白细胞，其功能不受胞内Ca2+调节，由细胞因子和内毒素调节[5]。NOS的激活依赖还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phos phate,NADPH），文献报道NADPH-d与nNOS在相同的细胞群中表达，并且两者的活性与NO的产生量呈平行关系。因此，NADPH-d组织化学染色可作为NOS以及NO生成量的非直接指示因素[6-7]。大量研究认为NO参与颌面部疼痛信号的调控[8-9]。探究NADPH-d在TG的分布情况对研究NO/NOS系统在颌面部疼痛传导通路中的作用十分必要。

因此该研究选择健康雌性大鼠，190～220 g，2015年5月，经心灌注固定取双侧三叉神经节，25 μm冰冻切片，采用组织化学染色方法研究NADPH-d在TG的表达情况。

1 材料与方法

主要实验试剂：NADPH-d（美国Sigma公司）硝基四唑氮蓝（美国Sigma公司）；实验动物选用健康成年雌性Sprague-Dewley大鼠6只，体重190～220 g，由广东省实验动物中心提供；4%多聚甲醛经心灌注固定，取 TG 梯度脱水，冰冻切片（25 μm）；NADPH-d组织化学染色；图像分析。

2 结果

NADPH-d在三叉神经节广泛表达，呈簇状紧密排列，以中小细胞为主。染色密度与细胞体积相关，即大体积细胞多数染色较淡或为阴性，边界不清晰。而大多中小体积细胞染色较深，见图1、表1。

图1 NADPH-d在三叉神经节（TG）神经元内的表达

图A,B：NADPH-d组织化学染色，图C,D：NADPH-d组织化学染色灰度照片。黑色/红色/蓝色箭头代表深染小细胞、中等大小细胞、浅染大细胞。比例尺：100 μm(C),50 μm(D)

表1 NADPH-d阳性细胞体积比例

3 讨论

结果表明NADPH-d在TG广泛分布，并且中小细胞染色较深，表现更高的NADPH-d活性，而大细胞染色较浅甚至表现为阴性，与Stoyanova等[6]与Fan等[10]在大鼠的检测结果及Kolesar[11]等在兔的检测结果类似。该次的结果还补充了中小细胞是主要的NADPH-d阳性细胞，占73.2%。中小体积TG细胞被认为是主要处理伤害性信息的细胞[10]，无论NADPH-d染色深度或数量占比，中小体积细胞均比大体积细胞突出，这为NONO/NOS系统参与颌面部疼痛调控提供了形态学支持。

除了类似的大鼠生理性形态研究外，也有一些检测NO/NOS在病理状态下的表达情况，主要集中在三叉神经系统初级与二级神经元，即三叉神经节、三叉神经中脑核与三叉神经脊束核。有研究[7]报道了一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）在 TG、三叉神经脊束核尾核及中脑导水管、丘脑等与疼痛相关核团均有表达，认为NO/NOS系统是偏头痛的发病机制之一。Liu等[12]报道了大鼠慢性牙髓炎模型中，NOS阳性神经元在TG的表达最早在第3天开始增加，第28天达到峰值。Sugiyama等[13]报道大鼠下牙槽神经横断可引起机械异常痛觉，并且NO代谢物及NOS阳性细胞在TG表达增加。在TG局部使用NOS选择性抑制剂可以消除异常痛觉而NOS底物可诱发异常痛觉。Huang F等[14]报道了在炎性痛的早期TG中、小神经元NADPH-d活性增强。这些证据表明NO/NOS系统参与颌面部疼痛调控。

然而，需要指出的是尽管以上研究倾向于NO在颌面部疼痛调控中发挥致痛作用，较早研究报道在糖尿病诱发神经痛的大鼠中，脊髓背根神经节的NADPH-d阳性细胞与nNOS表达明显减少，而且胰岛素治疗可以逆转这一效应，这提示NO可能起抑痛作用[15]。Hashemi M等[16]在吗啡镇痛的大鼠福尔马林测试中观察到NO存在镇痛/抑痛的复杂作用。研究认为这可能与NO的浓度相关；不同的伤害形式、持续时间和强度等激活不同的传入神经对于nNOS的表达起关键性作用，也可能影响NO的疼痛调控作用[17-18]。

综上所述，NO/NOS系统在颌面部疼痛中调控中发挥重要作用，但当前结果远远不足以阐明其具体机制。至今，NADPH-d阳性细胞在三叉神经通路的整体表达尚未明确，尤其是丘脑腹后内侧核与大脑皮层等，值得进一步研究；与一些信号因子如降钙素基因相关肽（calcitonin-gene-related peptide，CGRP）的关系也有待深入研究。

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