一株茶大灰象甲寄生真菌的分子鉴定及其毒力测定

王定锋，李良德，李慧玲，张辉，王庆森，吴光远

福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015

茶大灰象甲(Sympiezomias citri)又名柑橘灰象甲，属鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae），是一种重要的农业害虫，主要以成虫咀食茶树、柑橘、桑树和油茶等多种经济作物的嫩芽枝叶为害为主，造成叶片残缺不全，也可啃食幼果使果面残留伤痕，甚至造成落果歉收，严重影响作物的产量和品质[1-2]。近年来，人们对食品安全问题的关注程度越来越高，促进了茶园、柑橘园等传统种植业向无公害和有机农业发展。但这种农业管理模式却使得茶大灰象甲的发生危害出现逐年加重的趋势，常爆发成灾[3-4]。长期以来，对茶大灰象甲主要还是以化学防治为主[4-9]。化学防治虽然在一定程度上可以快速有效地防治该象甲，但化学农药的长期大量使用所引起的农业“3R”问题，严重影响生态环境和人类健康。物理防治和农业防治虽然具有一定的效果，但耗时费力，不利于大面积的防治。因此，有必要寻找更加合适的防治手段来控制茶大灰象甲的发生和危害。

布氏白僵菌（Beauveria brongniartii），又名卵孢白僵菌，是一种重要的昆虫病原真菌，可寄生7个目70多种昆虫，尤其对鞘翅目害虫具有独特的寄生效果，被广泛用于农林生态系统中金龟子和天牛等鞘翅目害虫的防治[10-14]。据Faria统计，全球（除中国外）已登记的171个真菌杀虫剂产品中，有7个产品是以布氏白僵菌为有效成份[15]。然而，当前还未见利用布氏白僵菌防治茶大灰象甲的报道。本研究对从茶大灰象甲自然羅病死亡的僵虫中分离到的一株昆虫病原真菌菌株的分类地位进行了分子鉴定，并测定其对茶大灰象甲成虫的毒力，旨在为今后利用该菌防治茶大灰象甲奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

虫生真菌 Bbr4941菌株分离自自然羅病死亡的茶大灰象甲成虫僵虫（僵虫采集自福建省福安市社口镇茶园），并用萨氏培养基Sabouraud dextrose agar plus 1% yeast extract（SDAY）试管斜面保存于4℃冰箱中。

1.2 培养基

萨氏培养基（SDAY）：4%葡萄糖、1%酵母、1%蛋白胨、2%琼脂，pH 7.0。高压灭菌锅121℃灭菌20 min。

1.3 供试虫源

于茶大灰象甲成虫发生高峰期，从茶园中采集成虫带回实验室，用新鲜茶梢饲养。2 d后挑选健康活跃、大小基本一致的成虫用于室内毒力测定。

1.4 菌株分子生物学鉴定

以菌株Bbr4941基因组DNA为模板，采用真菌通用引物ITS 1 （5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′） /ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′）[16]PCR扩增菌株rDNA-ITS序列；采用引物 B5.1F（5′-CGACCCGGC CAACTACTTTGA-3′） /B3.1R （ 5′-GTCTTC CAGTACCACTACGCC-3′）[17]扩增菌株 Bloc序列。rDNA-ITS序列和Bloc序列的PCR反应程序都为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，70℃ 30 s，30个循环；70℃延伸5 min。两个片段的PCR反应体系都为：2×TaqMix 10 μL，模板 DNA 1 μL，引物（10 mmoL）各 1 μL，ddH2O 12 μL，总共 25 μL。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化，送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。分别将rDNA-ITS序列和 Bloc序列测序结果通过 Blastn程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）与在GenBank中的基因序列进行同源性分析。下载常见近缘种的 rDNA-ITS序列和 Bloc序列，分别用MEGA4.0软件ClustalX方法进行多序列比对，并以邻接法（neigbor-joining method）分别构建分子系统发育树，用 Bootstrap对系统树进行检验，1 000次重复[18]。

1.5 菌株对茶大灰象甲成虫毒力测定

从SDAY平板上培养15 d的Bbr4941菌株中收集分生孢子，用0.05%吐温-80溶液搅拌 均 匀 ， 配 成 每 毫 升 5.0×107、 1.0×107、5.0×106、1.0×106孢子4种孢悬液。参照王定锋等[19-20]的方法进行浸虫处理及培养，具体操作为：茶大灰象甲成虫浸入孢悬液3~5 s后，立即取出，用无菌滤纸去除多余菌液后置于容量为1 L的塑料杯中，并用基部包有湿润的无菌脱脂棉的新鲜茶枝饲养，每2 d更换1次茶枝。塑料杯口用纱网封住，置于人工气候箱中（25℃、95%相对湿度和12L/12D的光周期）。每个浓度为 1个处理，每个处理15头茶大灰象甲成虫，重复3次，以0.05%吐温-80溶液为对照。从处理后第2天开始，每天定时观察各处理的死亡情况、做好记录，同时将死虫移出放于盛有湿滤纸的培养皿内保湿培养，观察菌丝生长及产孢情况，并统计死亡率、校正死亡率和僵虫率（虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子），并按照以下公式计算：

死亡率=死亡虫口数/处理总虫数×100%；

校正死亡率＝（处理组死亡率－对照组死亡率）/（1－对照组死亡率）×100%；

僵虫率=死亡后形成僵虫的虫数/处理总虫数×100%。

2 结果与分析

2.1 昆虫病原真菌Bbr4941的分子鉴定

昆虫病原真菌Bbr4941菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列PCR扩增、测序，分别获得长度为590 bp和1 494 bp的基因片段，GenBank登录号分别是MG837273和MG837274。通过Blast与GenBank中已有的核酸序列进行比对，结果表明，与Bbr4941菌株rDNA-ITS序列和Bloc序列相似性达100%的大部分序列分别都是布氏白僵菌的rDNA-ITS序列和Bloc序列。为进一步明确菌株Bbr4941与几种常见白僵菌的亲缘关系，分别选择GenBank中已公布的或Rehner等报道[17]中确认的6种分类地位比较明确的白僵菌[多形白僵菌（Beauveria.amorpha）、（狭义）球孢白僵菌（B. bassiana）、布氏白僵菌（B. brongniartii）、苏格兰白僵菌（B.caledonica）、马拉维白僵菌（B.malawiensis）和蠕孢白僵菌（B.vermiconia）]的rDNA-ITS序列和Bloc序列，分别用MEGA 4.0软件邻接法构建系统发育树（图1，图2）。从图1和图2两个系统发育树都可以看出，菌株Bbr4941与其他布氏白僵菌聚在一个较小的进化分支上，具有很高的同源性，因此我们判定昆虫病原真菌Bbr4941菌株为布氏白僵菌。

2.2 布氏白僵菌Bbr4941对茶大灰象甲成虫的毒力

从图3可以看出，随着布氏白僵菌Bbr4941孢子浓度的增加和处理时间的推移，茶大灰象甲成虫的死亡率不断升高。每毫升5.0×107和1.0×107孢子处理时，第4天试虫开始大量死亡；第7天累计死亡率分别为100%和97.22%。每毫升5.0×106、1.0×106孢子处理时，从第5天开始，试虫死亡率才开始大量增加，第7天累计死亡率分别为75%和61.11%。从表1可以看出，布氏白僵菌Bbr4941对茶大灰象甲成虫的杀虫毒力存在明显的时间-剂量效应。孢子浓度越高，茶大灰象甲成虫的LT50值越小。当达到每毫升1.0×106~5.0×107孢子时，处理7 d，茶大灰象甲成虫死亡率为61.11%~100%，LT50值为5.921~3.916 d。应用SPSS软件的probit程序计算出布氏白僵菌Bbr4941对茶大灰象甲成虫第7天的LC50值为每毫升8.33×105孢子，95%置信区间为每毫升2.43×105~1.49×106孢子。

3 讨论

昆虫病原真菌侵染寄主包含体表附着、体壁穿透和体内定殖3个阶段，整个过程涉及寄主识别、机械破坏、营养竞争、代谢干扰、毒素分泌及寄主组织结构破坏等，这些因子共同作用最终导致寄主死亡[21]。这种独特的杀虫方式，使害虫不能产生抗性，且具有易于生产、环境兼容性好和对靶标害虫专一等优势，在茶大灰象甲的田间大面积防治上具有极大的应用潜力。本研究获得的布氏白僵菌 Bbr4941孢悬液（每毫升5.0×107孢子）处理茶大灰象甲成虫7 d，其累计校正死亡率为100%，LT50为3.916 d；该结果与王定锋等[22]通过室内毒力测定，从15株白僵菌菌株中筛选出的对茶大灰象甲成虫高毒力的球孢白僵菌菌株Bb2-1的杀虫活性相当，说明布氏白僵菌Bbr4941也具有很强的杀虫活性和生防潜力。此外，本研究获得的茶大灰象甲寄生菌 Bbr4941为布氏白僵菌，在分类上与球孢白僵菌属于同属不同种，这也进一步丰富了茶大灰象甲生防真菌的资源库，将在今后茶大灰象甲的田间防治中发挥重要作用。

图1 基于rDNA-ITS序列的Bbr4941菌株及白僵菌类群的系统发育树Fig. 1 Phylogeny analysis of rDNA-ITS gene sequences of Bbr4941 and Beauveria

图2 基于Bloc序列的Bbr4941菌株及白僵菌类群的系统发育树Fig. 2 Phylogeny analysis of Bloc gene sequences of Bbr4941 and Beauveria

图3 白僵菌Bbr4941不同孢子浓度对茶大灰象甲成虫的毒力Fig. 3 The toxicity of Bbr4941 against the adults of S. citri

表1 不同孢子浓度下菌株Bbr4941对茶大灰象甲成虫的毒力Table1 Virulence of the strain Bbr4941 against adults of S. citri under different spore concentrations

随着分子生物学技术的飞速发展，GenBank数据库中真菌的各种标记序列不断增多，给真菌新菌株的分子鉴定奠定了坚实的基础。Johny等[23]通过对 ITS，EF1-a和 Bloc片段的扩增和测序，从分子水平上对分离自鞘翅目害虫（Agrilus planipennis）爆发的森林中分离到的78个白僵菌菌株进行鉴定，并明确了这些菌株的分类地位。Carrillo-Benítez等[24]利用ITS和EF1-a对分离自蛴螬幼虫的17株白僵菌进行了分子鉴定，发现所有的白僵菌都属于（Beauveria pseudobassiana）。为明确从瑞士境内获得的花粉甲虫白僵菌的分类归属，Meyling等[25]通过对菌株 ITS，EF1-a和 Bloc片段的扩增和测序，最终确定了这些白僵菌包括球孢白僵菌和布氏白僵菌。Medo等[26]利用ITS和Bloc序列对分离自斯洛伐克土壤的109个白僵菌进行鉴定，结果表明这些菌株包括B. bassiana，B. pseudobassiana和B.brongniartii3大类。本研究通过对分离自茶大灰象甲僵虫的昆虫病原真菌 Bbr4941菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列的扩增、测序和系统发育树构建，明确了所获得的Bbr4941菌株是布氏白僵菌，该结果也进一步证实了前人利用真菌常用标记序列可有效地对新分离到的菌株进行分子鉴定的结论[23-26]。

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